Le Loup et l’Agneau de Jean de La fontaine.

III.12.1. Hibridação Molecular de RNA

Para o estudo da expressão dos elementos homólogos a hAT do grupo I, foi realizado ensaio de hibridação molecular de RNA. Investigou-se se este grupo apresentaria um padrão de expressão diferenciado em folhas, raízes e calos de cana-de-açúcar. As manipulações de RNA requerem um tratamento diferenciado de todo o material a ser utilizado, para a eliminação das RNases. Toda a vidraria, assim como cadinhos, bastões e espátulas devem ser tratados com clorofórmio, enxaguados com água deionizada e esterilizados por autoclavagem de 20 minutos a 120oC. Cubas de eletroforese, pentes e suportes para o preparo dos géis devem ser tratados por 16 horas com uma solução de NaOH 0,2N e enxaguados com água deionizada. Toda a água deionizada empregada no preparo das soluções utilizadas no procedimento deve ser tratada com DEPC. Foram utilizadas pipetas e ponteiras descartáveis e todo o procedimento foi feito com luvas.

Água DEPC – a água deionizada é acrescida de 0,01% DEPC (Sigma), e fica mantida a 37oC por 16 horas. Após este período é autoclavada por 20 minutos a 120oC. Este tratamento inativa RNases presentes na água.

A extração de RNA dos materiais vegetais foi feita utilizando-se o método do cloreto de lítio. Para cada amostra da extração foram pulverizados 100 mg de material, em cadinhos de porcelana contendo nitrogênio líquido, até obter-se um pó fino. Este pó foi transferido para microtubos de 1,5 mL, aos quais se adicionou 0,5 mL de tampão de extração e 0,5 mL de fenol:clorofórmio 1:1. O material foi homogeneizado por agitação em “vortex” por 30 segundos, e em seguida centrifugado a 13.000g por 5 minutos a 4oC. A fase aquosa contendo o RNA foi transferida para novos tubos, e repetiu-se a extração com tampão de extração e fenol:clorofórmio 1:1. A fase aquosa foi transferida para novos tubos em que se adicionou o mesmo volume de LiCl 6M. As amostras foram mantidas a 4oC por 16 horas. Após este período, foram centrifugadas a 13.000g por 10 minutos a 4oC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 1 mL de LiCl 3M, seguido de uma nova centrifugação. Novamente o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 250µL de água deionizada tratada com DEPC. Uma breve centrifugação de 30 segundos a 13.000g foi realizada, para precipitar eventuais partículas de matéria insolúvel que ainda permanecessem nas amostras. O sobrenadante foi recolhido e passado para novos tubos, aos quais foi adicionado 1/10 do volume de acetato de sódio 3M, e 2X o volume de etanol 100%. Em seguida os tubos foram mantidos a -80oC por 15 minutos para precipitação do RNA, centrifugados a 13.000g por 15 minutos a 4oC e o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi lavado com 0,5 mL de etanol 70% gelado, centrifugado 13.000g por 5 minutos a 4oC e o etanol 70% foi descartado. O RNA precipitado foi ressuspendido em 50 µL de água deionizada tratada com DEPC, ficando por 10 minutos a 55oC para ajudar na solubilização. Os RNAs ficaram estocados em congelador a -80oC.

LiCl 6M – 127,2 g de cloreto de lítio em pó dissolvidos em 500 mL de água deionizada. Esterilizar por autoclavagem a 120oC por 20 minutos.

Tampão de extração – Tris-Cl (0,2M); LiCl (0,1M); EDTA (5mM) e SDS 1%.

Os RNAs foram migrados em gel desnaturante de agarose, constituído de 1,5% agarose; 6,7% Formaldeído; MOPS 1X e água deionizada. A agarose foi adicionada à água e levada ao microondas para dissolver. Após esfriar para 60oC, o MOPS 10X e o formaldeído 37% foram adicionados ao gel para que ficassem nas concentrações mencionadas acima. O gel ficou polimerizando dentro de uma capela com exaustão, para evitar que vapores do formaldeído saíssem para o ambiente. A eletroforese foi realizada em Tampão MOPS 1X. Foi feita uma pré- corrida do gel antes de aplicar as amostras, de 15 minutos a 80V. As amostras a serem aplicadas no gel constituíram-se de 10 µg de RNA em 10µL, acrescidos de 4,6µL de MOPS 10X; 8,2µL de formaldeído 37% e 22,8µL de formamida. Estas ficaram incubadas por 15 minutos a 60oC e em seguida, adicionadas de 9,0µL de tampão de amostra e 1,0µL de brometo de etídeo a 4µg/mL. As amostras foram então aplicadas no gel e realizou-se uma eletroforese a 80V por 3 a 4 horas. Após a eletroforese, o gel foi lavado três vezes por 10 minutos com água deionizada e uma vez com SSC 10X por 40 minutos.

MOPS 10X – MOPS pH 7,0 (0,2 M); Acetato de sódio pH 7,0 (0,5 M) e EDTA (10mM).

Tampão MOPS 10X – MOPS pH 7,0 (0,4 M); Acetato de sódio pH 7,0 (0,1 M) e EDTA (10mM).

Tampão de Amostra – Azul de bromofenol (0,25%); xileno cianol (0,25%); EDTA (1mM) e glicerol (50%).

III.12.1.3. Transferência (Northern Blot)

A transferência ocorreu em SSC 10X, por capilaridade. Esta foi montada colocando-se o gel sobre papel filtro em contato com o SSC 10X da cuba de transferência. Uma membrana de náilon (“Gene Screen Plus Hibridization Transfer Membrane” – NENTM Life Science), previamente umedecida com água deionizada e mantida por 10 minutos em SSC 10X, foi depositada sobre o gel e

transferência transcorreu por um período de 18 horas. Após este período a membrana foi enxaguada rapidamente em SSC 10X, levada ao forno a 80oC por 2 horas e exposta à luz UV por 1 minuto, com a face contendo os RNAs para cima, para sua fixação.

III.12.1.4. Sondas

Foi utilizada na hibridação de RNA a sonda amplificada a partir do TE074 (grupo I) com os iniciadores “SHAT-2-F” e “SHAT-2-R” (figura 6-A), como descrito no item III.11.1.1.

Como controle constitutivo foi utilizada uma sonda obtida a partir da ubiquitina da cana-de-açúcar, gentilmente cedida pela Profa. Dra. Kátia C. Scortecci (UFRN).

III.12.1.5. Marcação das Sondas

As sondas foram marcadas com P α32 dCTP, utilizando-se o “Kit Random Primers DNA Labelling System” da Invitrogen, de acordo com as instruções do fabricante, seguido dos procedimentos descritos no item III.11.1.6.

III.12.1.6. Hibridação

As membranas foram colocadas na pré-hibridação em garrafas apropriadas contendo 30mL de solução de hibridação, e ficaram no forno com rotação, a 65oC por 4 horas. As sondas marcadas foram então adicionadas às garrafas, que voltaram para o forno com rotação a 65oC por um período de 40 horas, para a hibridação.

Solução de Hibridação – Tampão fosfato pH 7,4 (0,5M); SDS (7%) e EDTA (1mM).

Após o período de hibridação as membranas passaram pelo processo de lavagem, que consistiu-se de uma lavagem com SSC 2X por 5 minutos à temperatura ambiente, duas lavagens de 30 minutos cada com SSC 2X / SDS 0,5% a 65oC, e mais uma lavagem com SSC 2X por 5 minutos à temperatura ambiente.

SSC 20X - Cloreto de sódio (3M) e citrato de sódio (0,3M), dissolvidos em água deionizada. Esterilizado em autoclave a 120oC por 20 minutos.

SDS 20% - 20% do peso/volume de SDS em pó dissolvido em água deionizada.

III.12.1.8. Exposição e Revelação

A exposição de filmes às membranas marcadas radioativamente, e a revelação dos filmes foi realizada do mesmo modo como nas hibridações moleculares com DNA. Estes procedimentos estão descritos no item III.11.1.9.

III.12.1.9. Análise das Autorradiografias Geradas com a Hibridação

A intensidade das bandas geradas pela hibridação molecular de RNA foi medida por densitometria, através do programa “Kodak Digital Science 1D”. Foram medidas as intensidades das bandas e da marcação de fundo. Os valores de fundo foram subtraídos dos valores medidos para as bandas. Para chegar a um valor relativo de expressão, os valores das bandas no filme marcado pela sonda do TE074 foram divididos pelos respectivos valores das bandas no filme marcado pela sonda constitutiva da ubiquitina. Os valores relativos de expressão são apresentados na forma deste quociente, em gráfico de barras.

III.13. Caracterização da Estrutura de Elementos do Genoma da Cana-de-