Hématopoïèse larvaire
A. Localisation de la glande lymphatique dans la larve Vue dorsale d’une larve au troisième stade Les lobes antérieurs
sont nécrosés et apparaissent noirs (M. Crozatier, non publié) B. Glande lymphatique vue en microscopie électronique à balayage. La flèche noire montre un lobe antérieur, les têtes de flèches blanches montrent des lobes postérieurs. D’après Meister and Lagueux 2003. C. Glande lymphatique vue en Nomarsky. Les lobes antérieurs et postérieurs sont indiqués. Les pointillés blanc délimitent la zone médullaire (ZM) qui a un aspect lisse. La zone corticale (ZC) a un aspect rugueux. D. Image confocale d’une glande lymphatique (image de Joanna Krzemień) où la ZM est marquée par dome- gal4/UASmCD8GFP (vert), la ZC contient des cellules à cristaux marquées par à un anticorps contre proPO (cellules à cristaux, rouge), le PSC est marqué par Col (bleu).
ZM ZC
Lobes antérieurs Lobes Lobes antérieurs Lobes postérieurs postérieurs ZM CZ PSC A B C D
Figure 7. Morphologie de la glande lymphatique au troisième stade larvaire.
A. Localisation de la glande lymphatique dans la larve. Vue dorsale d’une larve au troisième stade. Les lobes antérieurs
sont nécrosés et apparaissent noirs (M. Crozatier, non publié) B. Glande lymphatique vue en microscopie électronique à balayage. La flèche noire montre un lobe antérieur, les têtes de flèches blanches montrent des lobes postérieurs. D’après Meister and Lagueux 2003. C. Glande lymphatique vue en Nomarsky. Les lobes antérieurs et postérieurs sont indiqués. Les pointillés blanc délimitent la zone médullaire (ZM) qui a un aspect lisse. La zone corticale (ZC) a un aspect rugueux. D. Image confocale d’une glande lymphatique (image de Joanna Krzemień) où la ZM est marquée par dome- gal4/UASmCD8GFP (vert), la ZC contient des cellules à cristaux marquées par à un anticorps contre proPO (cellules à cristaux, rouge), le PSC est marqué par Col (bleu).
ZM ZC
Lobes antérieurs Lobes Lobes antérieurs Lobes postérieurs postérieurs ZM PSC CZ A B C D
Vous avez dit hémangioblaste ?
Il a été proposé que, dans l’embryogenèse des vertébrés, les cellules sanguines et les cellules endothéliales partagent un précurseur commun appellé hémangioblaste (Medvinsky and Dzierzak, 1996), 1996 ; Kennedy et al., 1997 ; Huber et al., 2004). Toutefois, même s’il existe des relations évidentes entre les progéniteurs des cellules sanguines et des cellules endothéliales, l’existence de l’hémangioblaste reste très controversée (Jaffredo et al., 2005 ; Bollerot et al., 2005 ; Ueno and Weissman, 2006). Chez la Drosophile, une analyse clonale des étapes précoces de l’ontogenèse de la glande lymphatique indique que les cardioblastes composant le tube cardiaque et les cellules de la glande lymphatique pourraient résulter de la division d’un progéniteur commun que les auteurs ont proposé d’appeler hémangioblaste (Mandal et al., 2004) Ces résultats relancent le débat sur l’existence et la conservation au cours de l’évolution de l’hémangioblaste.
Zones Médullaire et Corticale : les hémocytes de la glande lymphatique
L’organisation structurale de la glande lymphatique, en trois zones distinctes, soulève la question de la signification fonctionnelle des différentes zones pour les hémocytes et leur différenciation. Les cellules de la ZM expriment domeless (dome) qui code pour le récepteur de la voie de signalisation JAK/STAT chez la Drosophile, ce qui peut être visualisé grâce au transgène pilote dome-Gal4 (pG125, Figure 7D (Bourbon et al., 2002; Jung et al., 2005)). Les cellules de la ZM sont des hémocytes indifférenciés ou prohémocytes, qui ont un diamètre de 4 à 6 µm, un ratio nucléoplasmique élevé et n’expriment aucun des marqueurs de différenciation des hémocytes. A l’inverse, les cellules de la ZC, correspondant aux hémocytes différenciés, n’expriment pas dome mais des marqueurs de différenciation (Jung et al., 2005). Jung et collaborateurs ont montré, par des expériences de lignage cellulaire, que les cellules de la ZC sont issues de la ZM. En effet, au deuxième stade larvaire la glande lymphatique est composée uniquement de précurseurs qui expriment dome. La ZC se forme progressivement, à partir du début du troisième stade larvaire, et est composée d’hémocytes différenciés (Figure 8 et (Jung et al., 2005)). Les mécanismes qui contrôlent la différenciation des hémocytes et leur sortie de la ZM reste encore à élucider.
Figure 8. Représentation schématique de la morphologie de la glande lymphatique en contexte physiologique et après infection par un parasitoïde.
L’ontogenèse de la glande lymphatique débute lors de l’embryogenèse. La glande lymphatique va croître au cours du développement larvaire puis éclater à la métamorphose en relâchant les hémocytes dans l’hémolymphe. Des marqueurs permettent de suivre les modifications morphologiques de la glande lymphatique au cours du développement. Le marqueur le plus précoce marquant la glande lymphatique est le facteur de transcription Collier (Col, bleu). Dans l’embryon Col est exprimés dans toutes la glande lymphatique puis son expression est restreinte au PSC au stade 16 (bleu). L’expression de dome (vert) débute au deuxième stade larvaire. Dans le PSC anpt et hh sont exprimés à partir du deuxième stade larvaire. Au troisième stade larvaire la ZC comprend des hémocytes différenciés (rouge). Puis à la métamorphose la glande lymphatique éclate. En cas d’infection par un parasitoïde des lamellocytes se différencient massivement. 24h après infection; la glande lymphatique est remplie de lamellocytes. 36h après infection elle éclate et libère les hémocytes dans l’hémolymphe.
Développement embryonnaire
Développement larvaire
22h 46h 70h
stade L1 stade L2 stade L3
Métamorphose
Col Col Antp
Col, Hh, Antp Col, Hh, Antp
Dome Dome P1 Pxn, ProPO, DoxA3, Lz 120h 0h 24h 36h
Infection par un parasitoïde
tube cardiaque cellules péricardiaques prohémocytes
hémocytes différenciés (plasmatocytes ou cellules à cristaux) lamellocytes PSC PSC PSC ZM ZM ZC Lobes postérieurs stade 16 stade 14
Figure 8. Représentation schématique de la morphologie de la glande lymphatique en contexte physiologique et après infection par un parasitoïde.
L’ontogenèse de la glande lymphatique débute lors de l’embryogenèse. La glande lymphatique va croître au cours du développement larvaire puis éclater à la métamorphose en relâchant les hémocytes dans l’hémolymphe. Des marqueurs permettent de suivre les modifications morphologiques de la glande lymphatique au cours du développement. Le marqueur le plus précoce marquant la glande lymphatique est le facteur de transcription Collier (Col, bleu). Dans l’embryon Col est exprimés dans toutes la glande lymphatique puis son expression est restreinte au PSC au stade 16 (bleu). L’expression de dome (vert) débute au deuxième stade larvaire. Dans le PSC anpt et hh sont exprimés à partir du deuxième stade larvaire. Au troisième stade larvaire la ZC comprend des hémocytes différenciés (rouge). Puis à la métamorphose la glande lymphatique éclate. En cas d’infection par un parasitoïde des lamellocytes se différencient massivement. 24h après infection; la glande lymphatique est remplie de lamellocytes. 36h après infection elle éclate et libère les hémocytes dans l’hémolymphe.
Développement embryonnaire
Développement larvaire
22h 46h 70h
stade L1 stade L2 stade L3
Métamorphose
Col Col Antp
Col, Hh, Antp Col, Hh, Antp
Dome Dome P1 Pxn, ProPO, DoxA3, Lz stade 16 stade 14 120h ZM ZM ZC Lobes postérieurs 0h 24h 36h
Infection par un parasitoïde
tube cardiaque cellules péricardiaques prohémocytes
hémocytes différenciés (plasmatocytes ou cellules à cristaux) lamellocytes
Les cellules du PSC, maintiennent l’expression de collier, n’expriment jamais dome ni aucun des marqueurs de différenciation des hémocytes. Les cellules du PSC sont une population de cellules à part qui ne participent à aucun des lignages hémocytaires. Le rôle du PSC dans l’hématopoïèse larvaire restait encore à élucider.
Dans les lobes secondaires très peu de cellules se différencient avant la métamorphose. La majorité des cellules sont des prohémocytes qui expriment dome-Gal4. Certaines cellules des lobes postétieurs expriment collier mais n’ont pas de localisation particulière et sont distribuées de manière sporadique à l’intérieur des lobes secondaires. Comme dans les lobes primaires, les cellules exprimant collier et celles exprimant dome-Gal4 sont deux populations mutuellement exclusives dans les lobes postérieurs.
Au moment où la glande lymphatique va éclater, au début de la métamorphose, elle possède toujours une ZM, une ZC et le PSC. Ainsi, elle relâche dans l’hémolymphe des hémocytes différenciés mais aussi des prohémocytes.
Cas particulier des lamellocytes et de la réponse au parasitisme
Comme décrit plus haut, lors d’une infection par un parasitoïde tel que la guêpe Leptopilina boulardi, la larve de Drosophile peut se défendre en produisant des lamellocytes dans la glande lymphatique. L’infection par le parasitoïde a lieu au cours du second stade larvaire (Figure3A). Les lamellocytes se différencient dans les lobes antérieurs puis dans les lobes postérieurs. La ZM, visualisée par l’expression de la GFP sous le contrôle du pilote dome- Gal4, disparaît environ 24 heures après l’infection et les prohémocytes se différencient majoritairement en lamellocytes (Krzemien et al., 2007). Entre 24 et 36 heures après l’infection, c'est-à-dire au début du troisième stade larvaire, la glande lymphatique éclate pour libérer ses hémocytes dans l’hémolymphe (Figure 8). Les lamellocytes relâchés dans l’hémolymphe vont alors s’agglutiner autour de l’œuf de guêpe, former une capsule et neutraliser son développement.
L’infection par un parasitoïde est donc un évènement capable de modifier le programme de différenciation des hémocytes de la glande lymphatique mettant en évidence une grande plasticité des hémocytes.
Fig. 9. Représentation schématique des protéines EBF de souris et Col de Drosophile.
Col/DmCOE et EBF/MmCOE1 définissent une nouvelle famille de facteurs de transcription caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN (DBD) uniquement présent dans cette famille de protéine, représenté en rouge. Le motif Hélice Boucle Hélice (Helix Loop Helix : HLH) et domaine Immunoglobuline-like/ Plexin/ Transcription factor (IPT) (jaune) sont impliqués dans la dimerisation. TAD pour le domaine transactivateur. Col et EBF présentent une forte homologie de séquence (d’après Daburon et al. 2008).
86% 89% Pourcentage d’acide aminés identiques
Fig. 9. Représentation schématique des protéines EBF de souris et Col de Drosophile.
Col/DmCOE et EBF/MmCOE1 définissent une nouvelle famille de facteurs de transcription caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN (DBD) uniquement présent dans cette famille de protéine, représenté en rouge. Le motif Hélice Boucle Hélice (Helix Loop Helix : HLH) et domaine Immunoglobuline-like/ Plexin/ Transcription factor (IPT) (jaune) sont impliqués dans la dimerisation. TAD pour le domaine transactivateur. Col et EBF présentent une forte homologie de séquence (d’après Daburon et al. 2008).
86% 89% Pourcentage d’acide aminés identiques
86% 89% Pourcentage d’acide aminés identiques
Collier
collier (col) code pour un facteur de transcription appartenant à la famille COE (Collier/ Olfactory-1/ Early B cell Factor), et est l’orthologue Drosophile de Early B-cell Factor (EBF) des vertébrés (Daburon et al., 2008; Dubois and Vincent, 2001). Col et EBF définissent une nouvelle famille de facteurs de transcription caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN uniquement présent dans cette famille de protéines, associé à un motif Hélice Boucle Hélice (Helix Loop Helix : HLH) et un domaine Immunoglobuline-like/ Plexin/ Transcription factor (IPT) impliqué dans la dimerisation. La comparaison des séquences Col et EBF montre que ces trois domaines protéiques sont extrêmement bien conservés au cours de l’évolution (Daburon et al., 2008; Dubois and Vincent, 2001). Col et EBF se lient à l’ADN sous forme d’homodimères (Figure 9 et (Daburon et al., 2008)). Tandis qu’il existe un seul gène chez la Drosophile, quatre membres de cette famille sont présent chez les vertébrés.
col est exprimé dans de nombreux tissus à la fois dans l’embryon et dans la larve. Il est exprimé dans un segment de la tête de l’embryon de Drosophile où son rôle a été initialement caractérisé (Crozatier et al., 1996). Il est également exprimé dans un muscle embryonnaire somatique, le muscle DA3, dans trois neurones multidendritiques du système nerveux périphérique et dans de nombreux neurones du système nerveux central. Différentes analyses fonctionnelles de col ont été réalisées dans les différents tissus (Crozatier et al., 1996; Crozatier et al., 1999; Crozatier and Vincent, 1999).
Au stade larvaire, col est également exprimé dans différents neurones du système nerveux central, mais aussi dans le disque imaginal d’aile et dans le PSC de la glande lymphatique. Son rôle dans les neurones larvaires n’a pas été analysé tandis que sa fonction dans la mise en place de la partie centrale de l’aile en réponse à la signalisation Hedgehog (Hh) a été caractérisée en détail. (Crozatier et al., 2002).
L’expression de col dans les cellules du PSC soulève la question de sa fonction dans l’hématopoïèse et offre un point d’entrée pour étudier la fonction des cellules du PSC.
Le PSC et le contrôle de l’hématopoïèse larvaire
Lebestky et collaborateurs ont initialement décrit le PSC comme étant un groupe de cellules, situées postérieurement dans les lobes antérieurs, qui expriment Serrate (Ser) un ligand de la voie de signalisation Notch (N). Serrate est exprimé non seulement dans les cellules du PSC