Résultats supplémentaires
A- I l’expression de dome-MESO, le rapporteur de l’activité de la voie de signalisation
JAK/STAT, est en rouge. La GFP (vert) marque les cellules sauvages, les clones de cellules mutantes pour latran (A-F) et dome (G-I) n’expriment pas la GFP.A-C. Glande lymphatique de larves saines. Les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme les cellules sauvages et maintiennent l’expression de dome-MESO. D-F. Glande lymphatique de larves vingt quatre heures après infection par un parasitoïde. Les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme les cellules sauvages et éteignent l’expression de dome-MESO. G-I. Glande lymphatique de larves saines. Les clones de cellules mutantes pour dome se comportent comme les cellules sauvages et maintiennent l’expression de dome-MESO.
A B C D E I H F G GFP GFP + dome latran latran latran latran latran dome dome latran
Figure 20. Latran agit de manière non cellulaire autonome.
A-I. l’expression de dome-MESO, le rapporteur de l’activité de la voie de signalisation
JAK/STAT, est en rouge. La GFP (vert) marque les cellules sauvages, les clones de cellules mutantes pour latran (A-F) et dome (G-I) n’expriment pas la GFP.A-C. Glande lymphatique de larves saines. Les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme les cellules sauvages et maintiennent l’expression de dome-MESO. D-F. Glande lymphatique de larves vingt quatre heures après infection par un parasitoïde. Les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme les cellules sauvages et éteignent l’expression de dome-MESO. G-I. Glande lymphatique de larves saines. Les clones de cellules mutantes pour dome se comportent comme les cellules sauvages et maintiennent l’expression de dome-MESO.
A B C D E I H F G
Figure 20. Latran agit de manière non cellulaire autonome.
A-I. l’expression de dome-MESO, le rapporteur de l’activité de la voie de signalisation
JAK/STAT, est en rouge. La GFP (vert) marque les cellules sauvages, les clones de cellules mutantes pour latran (A-F) et dome (G-I) n’expriment pas la GFP.A-C. Glande lymphatique de larves saines. Les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme les cellules sauvages et maintiennent l’expression de dome-MESO. D-F. Glande lymphatique de larves vingt quatre heures après infection par un parasitoïde. Les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme les cellules sauvages et éteignent l’expression de dome-MESO. G-I. Glande lymphatique de larves saines. Les clones de cellules mutantes pour dome se comportent comme les cellules sauvages et maintiennent l’expression de dome-MESO.
A B C D E I H F G GFP GFP + dome latran latran latran latran latran dome dome latran dome-MESO dome-MESO
différents suggérant que leurs expressions sont contrôlées par différentes séquences régulatrices ou CRM (Cis Regulatory Modules). De plus, après une infection par des guêpes l’expression de dome est diminuée tandis que celle de latran n’est pas modifiée indiquant que leurs expressions sont contrôlées, au moins partiellement, par des CRMs différents. Dans de nombreux tissus dome est lui-même un gène cible de la voie de signalisation JAK/STAT. Dans la glande lymphatique, dome-MESO, le rapporteur de l’activité de la voie, correspond à un fragment génomique de dome incluant l’intron 1 cloné en amont de la-galactosidase (Hombria et al., 2005). Ainsi, le maintien de l’expression de dome dans la MZ est probablement sous le contrôle de la voie JAK/STAT. Comment l’expression de dome est diminuée suite à un parasitisme reste non établi. La diminution de l’expression de dome pourrait être soit la conséquence de l’inactivation de la voie JAK/STAT en réponse à l’infection soit la cause de l’inactivation de cette voie. Les données actuelles ne permettent pas de trancher entre ces deux possibilités. En ce qui concerne latran, son expression au contraire de celle de dome, est indépendante à la fois de la voie JAK/STAT et de l’infection par les guêpes. Une analyse détaillée des CRMs contrôlant la transcription de dome et latran devrait être envisagée. Pour cela, la comparaison des séquences des différents génomes de Drosophiles devrait permettre de mettre en évidence des séquences non codantes conservées entre les différentes espèces. Ces séquences pourraient correspondre à des régions régulatrices fonctionnelles. L’identification des différents CRMs responsables de l’expression spécifique dome et latran pourrait permettre de mieux comprendre comment sont régulés ces deux gènes en condition normale et suite à un parasitisme.
Par des expériences d’expression ectopique, nous avons montré que Latran peut antagoniser la fonction de Dome non seulement dans la glande lymphatique mais également dans d’autres tissus où la voie de signalisation JAK/STAT est activée. La restriction de l’expression de latran à la ZM suggère qu’il n’est impliqué que dans la réponse immunitaire cellulaire. Il est intéressant de noter que certaines espèces de Drosophiles, telle que D. subobscura sont incapables de former des lamellocytes suite à une infection par un parasitoïde (Eslin and Doury, 2006). Les processus moléculaires responsables de cette immunodéficience restent non connus. L’hypothèse la plus simple est que dans cette espèce la voie de signalisation JAK/STAT n’est pas inhibée suite à un parasitisme et par conséquent les prohémocytes sont incapables de se différencier en lamellocytes. latran pourrait être le chaînon manquant dans ce processus. Cependant, D. subobscura possède des orthologues de dome et latran dans son génome. L’acquisition de nouvelles fonctions au cours de l’évolution résulte de modifications spatiales et temporelles de l’expression génique (pour revue (Simpson, 2007)). En effet, de
nombreuses études récentes ont corrélé des différences morphologiques entre différentes espèces de Drosophile à des changements dans des séquences cis-régulatrices (Jeong et al., 2008; McGregor et al., 2007; Williams et al., 2008). Ainsi, la première étape pour déterminer si latran est impliqué dans l’immunodéficience de D.subobscura serait d’établir son profil d’expression dans cette espèce.
Nos résultats indiquent que suite à une infection par un parasitoïde le rapport des transcrits latran/dome est augmenté. Malheureusement, nous n’avons pas les moyens de vérifier le niveau relatif des protéines Dome et Latran in vivo. En effet, ni les anticorps dirigés contre Dome que nous a donnés Stéphane Noselli (Devergne et al., 2007) ni les anticorps que nous avons générés dans notre laboratoire (voir Matériel et Méthodes) ne permettent de détecter les protéines in vivo dans la glande lymphatique. Il est probable que, soit le niveau d’expression des deux protéines est trop faible, soit elles sont instables ce qui expliquerait notre incapacité à les détecter. En culture de cellules, grâce à l’utilisation de protéines Dome et Latran étiquetées, nous avons pu suivre leur localisation subcellulaire. Dans des conditions où la voie de signalisation JAK/STAT est inhibée par Latran, Latran et Dome co-localisent dans des vésicules cytoplasmiques. Devergne et collaborateurs ont montré que l’endocytose du complexe Dome/Upd est nécessaire pour la transduction du signal (Devergne et al., 2007). Nos résultats indiquent que Latran n’empêche pas l’endocytose du complexe Dome/Upd et qu’il est endocyté avec Dome. L’étape suivante sera de déterminer comment Latran antagonise la voie de signalisation JAK/STAT. Une façon d’apporter une réponse à ce point est de définir les rôles respectifs des domaines extra et intra cellulaires des récepteurs Dome et Latran. La construction de protéines chimères entre Dome et Latran, par exemple avec la partie extracellulaire de Latran associée à la partie intracellulaire de Dome et inversement (comme cela a été réalisé précédemment lors de l’étude des récepteurs des vertébrés par Baumann et collaborateurs en 1994) peut être envisagée. La fonction de ces protéines chimères pourrait être testée en culture de cellule et in vivo. Il serait intéressant de déterminer si par exemple, Latran peut signaler avec le domaine intracellulaire de Dome et si Dome peut antagoniser la voie de signalisation JAK/STAT avec le domaine intracellulaire de Latran. La diminution drastique et rapide de l’accumulation des ARNs messagers de dome et upd3, quatre heures après infection par un parasitoïde, suggère une inhibition de leur transcription qui pourrait être également associée à un contrôle post-transcriptionnel de la stabilité des ARNs messagers de dome et upd3. Les AUBPs (AU Binding Proteins) sont capables, en se fixant sur des séquences ARE (AU Rich Elements) présentes dans les régions 3’ non traduites
Chi and Morello, 2008). Grâce à l’aide de Nathalie Vanzo nous avons pu identifier des séquences ARE dans la région 3’ non traduite d’upd3. Ainsi, upd3 pourrait être soumis à une régulation post-transcriptionelle par des AUBPs. Par ailleurs, il existe aujourd’hui des banques de données permettant de prédire si une séquence peut être la cible de micro ARNs. Toujours avec l’aide de Nathalie Vanzo, nous avons pu voir que la région 3’ non traduite de dome contient des sites complémentaires pour trois micro ARNs. Il serait donc intéressant de vérifier si dome est la cible de micro ARNs. Une première étape pourrait être de vérifier, par Northern blot sur des ARNs extraits à partir de glandes lymphatiques, si les micro ARN prédits sont présents.
L’analyse des clones mitotiques pour latran et dome dans la glande lymphatique, suggère que Latran et Dome agissent de manière non cellulaire autonome. Malheureusement, ces résultats sont discutables en ce qui concerne dome. En effet, les seuls mutants disponibles pour ce gène correspondent à des insertions d’éléments transposables P dans la région régulatrice du gène (Bourbon et al., 2002). Le fait que des cellules mutantes pour dome se comportent comme des cellules sauvages est un résultat très étonnant sachant que jusqu’à présent toutes les données de la littérature indiquent que Dome agit de façon cellulaire autonome. Les deux allèles mutants de dome utilisés dans notre étude, sont des mutants d’expression et non des mutants nuls protéiques. Ainsi l’hypothèse la plus plausible est que ces deux allèles ne sont pas mutants dans la glande lymphatique. Une analyse par hybridation in situ devrait permettre de vérifier si les clones de cellules mutantes pour dome l’expriment ou non. En ce qui concerne latran, nous avons été très surpris de voir que, suite à une infection par un parasitoïde, les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme des cellules sauvages et vont éteindre la voie de signalisation JAK/STAT. Deux possibilités pourraient expliquer la fonction non cellulaire autonome de latran : i) soit il existe une forme soluble du récepteur Latran après infection, ii) soit le ligand Upd3 est une cible de la voie de signalisation JAK/STAT et est le composant limitant pour l’activation de la voie.
i) Existence d’une forme soluble de Latran. Chez les vertébrés il existe des formes solubles
des récepteurs des cytokines de classe I résultant soit d’épissages alternatifs soit de coupures protéolytiques des formes pleines taille. Les formes solubles agissent comme des antagonistes de la voie JAK/STAT en titrant les cytokines. Basé sur ces données il est possible que des formes solubles de Latran puissent également exister chez la drosophile. Nous avons donc décidé de tester si Latran pouvait exister sous forme soluble. Des expériences ont été réalisées en culture de cellules après transfection avec un vecteur permettant l’expression de latran. Ni l’analyse du surnageant par Western blot, ni le transfert de ce surnageant sur des cellules
exprimant des rapporteurs de la voie de signalisation JAK/STAT, n’a permis de mettre en évidence l’existence d’une forme soluble de Latran. La surexpression de latran dans toutes les cellules de la glande lymphatique (avec le pilote srp-Gal4) permet de sauver les mutants latran. Par contre, la surexpression de latran dans les cellules du PSC (grâce au pilote pcol85- Gal4) ne sauve pas les mutants latran indiquant que latran doit être exprimé dans les cellules de la ZM pour sauver le phenotype L’ensemble de ces résultats suggèrent qu’il n’existe pas de forme soluble pour Latran.
ii) Upd3 est le facteur limitant pour l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT.
Après infection il y a une forte diminution de l’expression de dome et upd3 dans la glande lymphatique. Upd3 est une molécule diffusible et peut donc agir sur les cellules voisines. Nous proposons que le faible niveau de Upd3 produit après parasitisme n’est pas suffisant pour maintenir la voie de signalisation JAK/STAT activée dans les clones de cellules voisines mutantes pour latran.
Cette étude a mis en évidence qu’un contrôle strict de la voie de signalisation JAK/STAT est nécessaire, suite à une infection par un parasitoïde, afin de permettre à l’hôte de survivre. Cependant, de nombreuses questions restent en suspens. En absence de parasitisme, quel est le signal emis par le PSC requis pour maintenir la voie JAK/STAT activée dans la ZM ? Comment les voies de signalisation Hh et JAK/STAT sont elles interconnectées ? Comment une infection par un parasitoïde induit-elle une diminution spécifique de l’accumulation des transcrits de dome et upd3 ? Quels sont les signaux émis lors d’une infection qui poussent les prohémocytes à se différencier en lamellocytes ? Comment les signaux émis par le PSC et requis pour le maintien de l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT en condition normale, sont antagonisés suite à une infection par un parasitoïde.
Des études, en cours au laboratoire, visent à identifier de nouveaux gènes exprimés dans la glande lymphatique. Par une approche basée sur l’analyse de transcriptomes, Delphine Pennetier recherche de nouveaux gènes exprimés dans la ZM, la ZC et le PSC. Elle s’intéresse également à l’identification de gènes dont l’expression est modifiée suite à une infection par un parasitoïde. De plus, Justine Oyallon développe une approche basée sur l’immunoprécipitation de la chromatine pour isoler les gènes cibles directs de Col dans le PSC. L’ensemble de ces études devrait nous permettre, à terme, de répondre aux questions posées et ainsi de mieux comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans le contrôle de l’hématopoïèse larvaire.