CHAPITRE II : les effecteurs innés de la défense cutanée
1. Les peptides antimicrobiens
1.1. LL-37
Le LL-37 est un PAM cationique appartenant à la famille des cathélicidines. Les cathélicidines ont en commun un domaine N-terminal très conservé, portant le nom de cathéline et un domaine antimicrobien C-terminal. Un seul gène codant pour les cathélicidines est présent dans le génome humain (Gudmundsson et al., 1996). Ce gène code pour un précurseur protéique de 18 kDa, la hCAP-18 « Human Cathelicidin Antimicrobial Protein » qui est clivée en peptide par la sérine-protéase-protéinase 3 pour générer le LL-37 doué
d’activité antimicrobienne (Sørensen et al., 2001).
Figure 10. Profils d’expression et fonctions des cathélicidines humaines cutanée.
Modifié d’après (Braff et al., 2005)
Le LL-γ7 est sécrété dans la sueur ce qui suggère qu’il joue une fonction de barrière
contre les infections locales, notamment contre Staphylococcus aureus et Candida albicans
(Murakami et al., 2004). De plus, LL-37 peut agir en synergie avec d’autres PAM, doué
d’activité chimiotactique pour les neutrophiles, les monocytes, les mastocytes et lymphocytes
T, stimule la prolifération des cellules endothéliales par liaison avec le « Formyl Peptide
Receptor-like I » (FPRL-1) et joue un rôle dans l’angiogenèse (Figure 10) (Koczulla et al.,
Une étude a montré que LL-γ7 peut agir en synergie avec l’IL-1 pour induire
l’expression d’effecteurs inflammatoires cytokiniques tels que l’IL-6 et l’IL-10 et de
chimiokines telles que CCL2 et CCL7 par les cellules mononucléées (Yu et al., 2007). En
outre, notre groupe a montré que les kératinocytes cultivés en présence d’IL-17A, d’IL-22,
d’IL-1α ou du TNFα surexpriment LL-37 (Guilloteau et al., 2010). Ensuite LL-37 et les
cytokines Th17 (IL-17 et IL-22) exercent une activité synergique en induisant la production
d’IL-6 et de CXCL8, lesquelles contribuent à l’inflammation cutanée dans le psoriasis (Chen
et al., 2013).
Une expression différentielle de LL-37 semble jouer un rôle dans la susceptibilité des patients atteints de maladies inflammatoires cutanées vers des complications infectieuses. Il est induit dans les kératinocytes des patients atteints de psoriasis, de lupus érythémateux, ou de dermatite de contact (Frohm et al., 1997). Sa surexpression dans le psoriasis est corrélée
avec un faible taux d’infection secondaire. En revanche, LL-γ7 n’est pas surexprimé chez les
patients souffrant de dermatite atopique, qui sont susceptibles à des infections virales ou bactériennes (Ong et al., 2002).
1.2. Les défensines 1.2.1. Généralités
Les défensines sont des PAM cationiques de poids moléculaire compris entre 3 et 5 kDa et résistantes aux protéases (Hoffmann et al., 1999). Chez les vertébrés, il existe 3
familles : les α, et θ-défensines. Elles ont un spectre d’activité très large allant des bactéries
à Gram positif au Gram négatif, aux champignons, aux virus enveloppés et aux protozoaires
(Jonard et al., 2006). Les - et -défensines auraient un gène ancestral commun et sont
présentes chez l’Homme (Hoffmann et al., 1999; Izadpanah and Gallo, 2005), tandis que les -défensines se trouvent seulement chez le singe (Rhésus macaque) et diffèrent des 2 autres
par leur structure (Diamond et al., 2009). Les défensines ont une structure commune
composée de trois feuillets plissés , incluant une hélice . Elles sont riches en arginine et
possèdent 6 résidus cystéines conservés qui forment 3 ponts disulfures intramoléculaires
(Chen et al., 2006). Leur classification est conditionnée par l’emplacement des ponts
disulfures (Selsted and Ouellette, 2005; Wiesner and Vilcinskas, 2010).
2006). Elles sont constituées de 29 à 50 acides aminés et sont caractérisées par la présence de ponts disulfures entre les résidus 1 et 6, 2 et 4, et 3 et 5 (Figure 11). HNP-2 est une forme tronquée des peptides HNP-1 ou HNP3 et dérive donc des gènes codants HNP-1 ou HNP-3.
Figure 11. Structure primaire et emplacement des ponts disulfures des α-, β-défensines humaines (Wiesner and Vilcinskas, 2010).
HNP-1, HNP-2 et HNP-3, et en faible quantité, HNP-4, sont principalement présents dans les granules azurophiles des polynucléaires tandis que HD-5 et HD-6 sont sécrétées par
les cellules de Paneth de l’intestin grêle (Wiesner and Vilcinskas, 2010). HNP-1, HNP-2 et
HNP-3 sont également produits par les NK, les lymphocytes T, les lymphocytes B et les
monocytes (Agerberth et al., 2000; Lehrer and Lu, 2012). Ces trois PAM sont doués d’activité
antimicrobienne vis-à-vis d’Escherichia coli, de Staphylococcus aureus et de Pseudomonas
aeruginosa (Harder and Schröder, 2005). Dans les maladies inflammatoires comme le
psoriasis, l’expression de ces trois défensines est augmentée dans la peau lésionnelle par
rapport à la peau normale, probablement produits par les polynucléaires neutrophiles (Harder and Schröder, 2005).
Les -défensines humaines (« Human Beta Defensin », HBD) sont constituées de 41 à 50 acides aminés et les ponts disulfures sont localisés au niveau des résidus 1 et 5, 2 et 4, et 3
et 6 (Figure 11). Actuellement il y a plus de 17 HBD chez l’Homme et elles ont une
distribution plus large dans l’organisme que les α-défensines dans l’organisme (Chen et al.,
2006). Les -défensines les plus décrites sont HBD-1 à 4 et elles ont été identifiées dans la
peau, les cellules épithéliales des voies respiratoires, le cœur ou encore dans les reins (Chen
-défensines
et al. 2006). Enfin elles ont un spectre d’activité très large contre une sélection de
microorganismes : des bactéries Gram positif comme Staphylococcus aureus et Streptococcus
pyogenes ; des bactéries Gram négatif comme Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa ;
et des champignons comme Candida albicans (Jonard et al., 2006).
Au niveau cutané, les -défensines sont, d’une part, d’importants effecteurs directs de
l’immunité innée afin de protéger l’organisme contre des infections locales et d’autre part,
modulent la réponse inflammatoire. Dans cet exposé, nous nous intéresserons plus
particulièrement aux rôles des -défensines HBD-1, HBD-2 et HBD-3 en physiologie mais
aussi à leur implication en situation pathologique.
1.2.2. HBD1
HBD1 est un PAM cationique composé de 36 acides aminés et de poids moléculaire
d’environ 4-5 kDa. Son spectre d’activité antimicrobienne est encore peu étudié mais elle agit
contre Escherichia coli et une bactérie à Gram positif : Streptococcus pyogenes (Jonard et al.,
2006). Elle a été initialement isolée à partir d’hémofiltrat de patients dyalisés (Bensch et al.,
1995). Elle a ensuite été retrouvée dans les épithéliums qui sont directement exposés à
l’environnement ou à la flore microbienne notamment au niveau du tissus cutané, des
poumons, des glandes sécrétoires ou du pancréas (Bensch et al., 1995; De Smet and Contreras, 2005). Au niveau cutané, HBD1 est constitutivement exprimée par les kératinocytes des couches supérieures (couche épineuse et couche cornée) et très faiblement
dans les couches basales indifférenciées, supportant l’hypothèse qu’elle participe à la défense
antimicrobienne de la peau (Ali et al., 2001).
1.2.3. HBD2
HBD2 est un PAM cationique de 43 acides aminés, de faible poids moléculaire (4 kDa) et a été isolée pour la première fois dans la peau de patients psoriasiques (Harder et al., 1997). Chez les sujets sains, elle est localisée en faible quantité au niveau de la couche épineuse et de la couche cornée (Ali et al., 2001). En situation inflammatoire comme par exemple le psoriasis, elle est retrouvée en grande quantité dans le cytoplasme des cellules de la couche épineuse et de la couche granuleuse (Harder et al., 2004; Huh et al., 2002; Liu et al.,
HDB2 est produite en grande quantité dans les lésions psoriasiques que dans ces 2 autres
maladies (Harder et al., 2004). Ce niveau d’expression élevée de HBDβ chez les patients
psoriasiques peut en partie expliquer pourquoi ces patients sont moins sujets aux infections bactériennes cutanées que les patients atopiques. Par ailleurs, 90% des patients souffrant
d’atopie cutanée sont colonisées par Staphylococcus aureus.
HBD2 exerce un effet bactéricide contre des bactéries à Gram négatif telles que
Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa mais elle a un effet bactériostatique contre une
bactérie à Gram positif, Staphylococcus aureus. En plus de sa capacité d’être un peptide
antimicrobien, HBD2 pourrait favoriser la réponse immune adaptative par le recrutement de cellules dendritiques et de lymphocytes T au niveau de la lésion à travers son interaction avec CCR6 exprimé sur ces cellules (Yang et al., 1999).
Parallèlement la stimulation des kératinocytes en culture par HBDβ induit l’expression et la production d’IL-6 et d’IL-10, mais aussi de chimiokines telles que CXCL20, CCL2,
CCL5 et CCL20 (Niyonsaba et al., 2007). De plus, elle favorise la prolifération et la
migration des kératinocytes in vitro en activant l’EGFR et les voies de signalisation « Signal
Transducer and Activator of Transduction » (STAT), STAT1 et STAT5 (Niyonsaba et al.,
2007). HBDβ est donc un acteur majeur de l’immunité cutanée à travers l’induction de la
production de cytokines et de chimiokines et sa participation à la réparation tissulaire lors des plaies en favorisant la prolifération et la migration des kératinocytes.
L’expression de HBDβ est augmentée par l’induction de la différenciation des
kératinocytes en présence de calcium (Harder et al., 2004). La stimulation des kératinocytes
en culture par l’IL-1, l’IL-1 ou le TNFα induit massivement la production de HBD2
(Harder et al., 2004; Huh et al., 2002; Liu et al., 2002). L’IL-17 (IL-17A et IL-17F) et l’IL-22
peuvent agir seule ou en synergie pour induire son expression (Liang et al., 2006). Plus
récemment notre laboratoire a montré que l’association de l’IL-1, du TNF, de l’oncostatine M (OSM), de l’IL-ββ et de l’IL-17A induit de manière synergique l’expression et la
production de HBD2 par les kératinocytes, constituant ainsi un modèle in vitro
d’inflammation cutanée (Guilloteau et al., 2010).
1.2.4. HBD3
HBD3 est un peptide de 5 kDa, hautement basique, composé de 45 acides aminés, découverte en 2000 dans les lésions psoriasiques. Elle a été identifié par son activité
antimicrobienne à large spectre, notamment contre Staphylococcus aureus ainsi que d’autres
bactéries buccales telles que Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Lactobacillus
acidophilus, mais aussi présente une activité fongicide à l’égard de Candida albicans (Harder
et al., 2001; Maisetta et al., 2003). Elle est présente dans la peau, la salive, l’œsophage, le
poumon, le cœur ou encore le placenta (Ghosh et al., 2007).
HBDγ est douée d’activité chimiotactique envers les monocytes et les cellules
exprimant CCR6 telles les DC immatures, les LB et les LT (Schröder and Harder, 2006).
Cette activité est dépendante de la topologie de ses ponts disulfures. En effet, l’absence de tout pond disulfure abolit son activité chimiotactique, suggérant qu’une structure
tridimensionnelle bien définie stabilisée par des ponts disulfures est requise pour la liaison à
CCR6. Il semble qu’à la différence son activité chimiotactique, l’activité bactéricide de HBDγ n’est pas affectée par l’absence de tout pont disulfure (Wu et al., 2003).
Comme pour HBD2, la stimulation de la différenciation des kératinocytes en culture
par le calcium induit très fortement l’expression de HBDγ (Harder et al., 2004). Elle est
également induite modérément par la stimulation des kératinocytes par le TNF et plus
fortement par l’IL-1 et l’INF (Harder et al., 2004). De même les facteurs de croissance
comme le « Transforming Growth Factor α» (TGF-α) ou l’ « Insulin-like Growth Factor I
(IGF-I) induisent seul ou en synergie, l’expression de HBDγ dans les kératinocytes (Sørensen
et al., 2003). Par ailleurs, l’expression de HBDγ peut être induite par Staphylococcus aureus
par l’intermédiaire du récepteur de reconnaissance de motifs moléculaires, « Toll-like Receptor » (TLR)2 (Détaillé dans le chapitre 3) présent sur les kératinocytes (Menzies and
Kenoyer, 2006). Enfin, tout comme HBD2 et LL-γ7, HBDγ induit l’expression d’IL-6, d’IL-
10, des chimiokines CXCL20, CCL2, CCL5 et CCL20, et participe à la migration et à la prolifération des kératinocytes en culture (Niyonsaba et al., 2007).
1.3. La famille des S100 1.3.1. Généralités
La famille des protéines S100 comprend 21 membres exprimés uniquement chez les vertébrés (Ravasi et al., 2004). De faible poids moléculaires (9 à 13 kDa), elles sont généralement caractérisées par une structure commune présentant 2 sites de liaisons au calcium de type « EF-hand » (EF : Elongation Factor) reliés par une région centrale charnière.
Le motif EF-hand est entouré par 2 hélices formant ainsi une structure en hélice-tour-hélice (Figure 12) (Ravasi et al., 2004).
Figure 12. Représentation schématique de la structure secondaire des protéines de la famille S100. Les boucles de type « EF hand », L1 et L2, sont flanquées par 2 hélices
(respectivement HI, HII et HIII, HIV). La région charnière relie les hélices HII et HIII.
Modifié d’après (Eckert et al., 2004).
L’établissement d’un arbre phylogénétique sur la base d’alignement multiple a révélé
4 groupes majeurs de protéines S100 (Figure 13). Le premier groupe comprend S100Z, S100P, S100A1 et S100B. Deux autres protéines S100A10 et S100A11 ont un degré de parenté proche de ce groupe. Le second est constitué de S100A2 à S100A6. Le troisième inclut S100A8, S100A9 et S100A12. Et le quatrième groupe, plus diversifié, comprend
S100A16, S100A1γ et S100A14. Actuellement, le groupe comprenant S100A7 n’est pas
encore classifié (Marenholz et al., 2004).
Dix-neuf membres de cette famille sont codés au niveau du complexe de différenciation épidermique du chromosome 1q21 où se trouvent également les gènes de la
loricrine, l’involucrine, la profilaggrine, les « Small Proline-Rich Proteins » (SPRR) et la
trichohyaline (Mischke et al., 1996). Elles peuvent être intra- ou extracellulaires et leurs activités sont dépendantes du calcium. Elles possèdent des fonctions biologiques très diverses : régulation de la prolifération et de la différenciation, apoptose, homéostasie du calcium,
inflammation et migration, au travers d’interactions avec un large panel de protéines dont des
enzymes, des sous-unités du cytosquelette, des récepteurs membranaires, des facteurs de
transcription mais aussi des acides nucléiques. Lorsqu’elles sont sécrétées dans le milieu
extracellulaire, elles peuvent agir de façon autocrine ou paracrine pour réguler la prolifération, la différenciation et la migration cellulaire, exercer leur activité antimicrobienne, aussi bien en
condition normale qu’en condition inflammatoire (Donato et al., 2013).
L1 L2 H I H II H III H IV Région charnière Domaine variable
Figure 13. Arbre phylogénétique des protéines S100 humaines.
D’après (Marenholz et al., 2004).
Parmi les 21 protéines S100 connues à ce jour, 11 (S100A2, S100A3, S100A4, S100A6, S100A7, S100A8, S100A9, S100A10, S100A11, S100A12 et S100A15) sont
exprimées au niveau de l’épiderme par les kératinocytes aussi bien en condition
physiologique que pathologique. En plus de ces 11 protéines S100, 2 autres peptides sont
exprimés au niveau de l’épiderme : S100B par les cellules de Langerhans et les monocytes et
S100P par les corpuscules de Meissner (Eckert et al., 2004).
Au vu de leur nombre élevé et de leurs fonctions et tissu cibles très divers, nous nous focaliserons sur les principales protéines S100 impliquées dans la prolifération et la différenciation des kératinocytes et/ou celles jouant un rôle effecteur dans la défense cutanée.
S100A2 est exprimée dans la couche basale de l’épiderme normal et dans les follicules
pileux (Böni et al., 1997; Nagy et al., 2002). Dans les kératinocytes en culture, elle est
localisée dans le noyau, puis est transloquée vers le cytoplasme lors d’un stress oxydatif
comme le psoriasis, la kératose actinique pigmentée ou le carcinome malphigien (Eckert et al., 2004). Par ailleurs S100A2 joue un rôle dans la différenciation des kératinocytes. En effet il a été montré que le gène S100A2 est la cible directe du facteur de transcription p53 et de ses
homologues et que l’inactivation de ces facteurs de transcriptions dans les kératinocytes
primaires, ou de S100A2 elle-même, réduit fortement l’expression de marqueurs de
différenciation comme la CK10 et l’involucrine (Lapi et al., 2006).
S100A4 est faiblement exprimée dans l’épiderme humain normal et est localisée dans
à proximité des follicules pileux chez la souris (Ito and Kizawa, 2001). Elle est surtout connue pour son rôle dans le développement du cancer. Elle est massivement produite et secrétée dans la peau psoriasique, plus précisément au niveau du derme supérieur par rapport à la peau saine (Zibert et al., 2010). Dans le derme psoriasique, S100A4 est colocalisée avec des marqueurs spécifiques des LT (CD3), des macrophages (CD68), des DC (CD1a), et des fibroblastes (vimentine). En parallèle, elle est colocalisée avec les LT et les LC dans
l’épiderme psoriasique (Zibert et al., 2010). Dans un modèle murin de xénogreffe de peau lésée de patient psoriasique, l’injection d’un anticorps bloquant S100A4 induit une diminution significative de l’épaississement de l’épiderme, de la prolifération cellulaire et de la
vascularisation du derme (Zibert et al., 2010).
S100A12 est considérée comme une protéine proinflammatoire et interagit avec
RAGE. Sa liaison avec RAGE active des voies de signalisation « Mitogen-Activated Protein
Kinase » (MAPK) et de « Nuclear Factor κB » (NFκB) induisant la sécrétion de cytokines proinflammatoires comme le TNFα et l’IL-1 (Yang et al., 2001). Elle est produite
majoritairement par les PN et les monocytes (Vogl et al., 1999). Elle possède une activité chimiotactique pour les monocytes/macrophages et les PN (Yang et al., 2001), suggérant son
rôle dans la réponse inflammatoire et notamment dans l’arthrite rhumathoïde et l’arthrite
psoriasique où son expression est fortement augmentée dans le tissu synovial inflammatoire comparé à des sujets sains ou à des sujets malades en fin de traitement (Foell et al., 2003).
Son expression est fortement augmentée par les kératinocytes stimulés par l’IL-1α ou l’IL-
17A (Guilloteau et al., 2010). De plus elle est surexprimée dans les couches suprabasales de
l’épiderme d’une peau psoriasique lésionnelle par rapport à une peau saine
Parmi les 21 protéines S100, S100A7, S100A7A (S100A15), S100A8 et S100A9 se démarquent par leurs propriétés antimicrobiennes.
1.3.2. S100A7
S100A7, aussi appelée psoriasine est une protéine de 11,7 kDa dont l’expression est fortement augmentée dans l’épiderme des patients atteints de psoriasis (Hoffmann et al.,
1994). A l’état physiologique, elle est faiblement exprimée dans le noyau et le cytoplasme des
kératinocytes de la couche basale de l’épiderme mais s’associe à la membrane plasmique dans
la couche épineuse (Broome et al., 2003). Elle est associée à la différenciation terminale des
kératinocytes et sa localisation en périphérie de la cellule suggère qu’elle puisse être rapidement secrétée. Un profil d’expression similaire est observé dans la peau psoriasique
lésionnelle avec une expression particulièrement prononcée au niveau de la couche épineuse.
Son implication dans la défense cutanée de l’hôte contre les microorganismes est
démontrée par sa puissante activité antibactérienne principalement vis-à-vis d’Escherichia
coli. Néanmoins elle est capable de neutraliser d’autres bactéries comme Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis et Pseudomonas aeruginosa (Gläser et al., 2005). Il a été montré que son activité de perméabilisation est dépendante du pH : elle est optimale à un pH compris entre 5 et 6, puis décroit avec la hausse du pH. Il semblerait que son activité de permébilisation des bactéries passe par un mécanisme de « barrel-stave » (Michalek et al., 2009). Ces données ont permis de comprendre la résistance de la peau à la colonisation
d’Escherichia coli en condition normale ou lors des infections. De plus, sa forte concentration suite à une rupture de la barrière épidermique observée chez les patients atteints de dermatite
atopique pourrait expliquer le fait que les patients souffrent moins d’infection cutanée causée
par Escherichia coli, en comparaison aux autres bactéries(Gläser et al., 2009).
Plusieurs études ont mis en évidence un certain nombre d’inducteurs de l’expression
de S100A7. Ainsi la production de S100A7 par les kératinocytes peut être induite par la
flagelline de Escherichia coli mais aussi par des cytokines proinflammatoires telles que l’IL-
1 et le TNF (Niyonsaba et al. 2008). Récemment, notre laboratoire a montré qu’un
mélange de 5 cytokines proinflammatoires constitué d’IL-17A, IL-22, IL-1, TNF- et
l’oncostatine M est capable d’induire une réponse de type psoriasique sur des kératinocytes en
culture. A ce titre, ces cytokines induisent de manière synergique la production de peptides antimicrobiens dont hBD2, hBD3 et S100A7, associée à une forte activité antimicrobienne
cytokines de type Thβ, principalement l’IL-4 et l’IL-13 (Gläser et al., 2009). La dermatite
atopique est caractérisée par la présence de LTh produisant des cytokines de type Th2 dont
l’IL-4 et l’IL-1γ, ce qui explique qu’il y a moins de S100A7 dans cette maladie que dans le
psoriasis.
S100A7 est douée d’activité chimiotactique envers les lymphocytes T CD4+
, les neutrophiles et les macrophages en interagissant avec le récepteur RAGE et en activant la voie de signalisation ERK1/2 (Jinquan et al., 1996; Wolf et al., 2008). S100A7 active également les neutrophiles qui vont alors produire des cytokines proinflammatoires et des
chimiokines telles que IL-6, IL-8, TNF, CCL3, CCL4 et CCL20 connues pour leur
contribution à la pathogenèse du psoriasis (Zheng et al., 2008). S100A7 induit également la
production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et la libération de défensines HPN1 à γ. Au travers de l’activation des neutrophiles elle participe donc à la mise en place de la réponse immunitaire innée au niveau des sites d’inflammation et/ou d’infection. Elle exerce également
des activités biologiques directes sur les kératinocytes notamment en induisant la libération de chimiokines telles que CXCL8, CXCL10 et CCL20 (Niyonsaba et al., 2008).
1.3.3. S100A15 (S100A7A)
S100A15 (11 kDa), également nommée S100A7A, a été clonée à partir de peau
psoriasique et partage 9γ % d’homologie avec la protéine S100A7 (Wolf et al., 2003). En
générale, les gènes des protéines S100 localisés au niveau du complexe de différenciation épidermique du chromosome 1q21 codent pour un transcrit unique. Néanmoins, pour celui de
S100A15, β transcrits issus d’épissage alternatif ont été détectés (S100A15-L et S100115-S)
(Wolf et al., 2003). A cause de son homologie de structure avec S100A7, l’étude de son
expression et de sa localisation s’avère difficile. Dans l’épiderme normal, S100A15 est exprimée dans les cellules épidermiques basales, les LC et les mélanocytes, tandis que S100A7 est exprimée dans la couche granuleuse et la couche cornée (Wolf et al., 2008).
Son homologie de structure avec S100A7 suggère qu’elles ont une activité biologique
en partie redondante. Des bactéries comme Escherichia coli, Staphylococcus aureus et
Pseudomonas aeruginosa peuvent induire son expression dans les kératinocytes en culture.
Parmi ces bactéries, Escherichia coli s’avère la plus puissante inductrice et cette induction est