Les cardiomyocytes adultes ont été obtenus à partir de plusieurs lignées de souris âgées de 2 à 5 mois, incluant des C57BL/6J (Centre d’Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, France), des souris transgéniques GCAG-GFP (données gracieusement par le docteur Fabrice Chrétien, Institut Pasteur, Paris, France) et des souris transgéniques ROSA26R (Okabe et al. 1997) (don gracieux du docteur Shaharagim Tajbakhsh, Institut Pasteur). Ces
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animaux ont été stabulés dans une animalerie thermostatée à 22°C avec un degré d’hygrométrie ambiante de 55%. Ils ont eu un libre accès à la nourriture et à la boisson et ont été soumis à un rythme nycthéméral imposé de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité. Les cardiomyocytes néonataux et les neurones des ganglions rachidiens ont été obtenus à partir de souriceaux et de souris de la lignée C57BL/6J (Centre d’Elevage Janvier).
Toutes les manipulations ont été réalisées en conformité avec la législation relative à l’expérimentation animale.
Cardiomyocytes adultes
Le protocole d’isolement a été adapté de Mitra et Morad (Mitra et Morad 1985). La souris a été anesthésiée par voie intrapéritonéale avec un mélange de 250 mg/kg de kétamine (kétamine 1000 Virbac France, Carros, France) et 10 mg/kg de xylazine (Rompun 2%, Bayer Santé, Puteaux, France) additionné de 500 U.I. d’héparine (Héparine Choay 25000 U.I./5 mL ; Sanofi Winthrop, Gentilly, France). Après anesthésie, le rongeur a subi une laparotomie médiane suivie d’une thoracotomie. Le cœur a été excisé le plus haut possible et immédiatement plongé dans une solution de perfusion ([mM] NaCl 113 ; KCl 4,7 ; KH2PO4 0,6 ; Na2HPO4 0,6 ; HEPES 10 ; MgSO4 1,2 ; NaHCO3 12 ; KHCO3
Le cœur excisé a été placé sur un appareil de type Langendorff par canulation de l’aorte pour être perfusé à pression et température (37°C) constantes par la solution de perfusion. Une fois l’organe rincé, la solution de perfusion a été remplacée par un tampon de digestion composé de solution de perfusion additionnée de CaCl
10 ; taurine 30 ; rouge de phénol 0,032 ; glucose 5,5 ; pH ajusté à 7,46) refroidie sur un lit de glace. Tous les produits proviennent de chez Sigma-Aldrich.
2 12,5 µM (Sigma-Aldrich) et d’enzymes (libérase TM Research Grade 0,1 mg/mL, Roche Applied Science, Meylan, France ; trypsine 0,14 mg/mL, Sigma-Aldrich). Lorsqu'il a été bien digéré, le myocarde prend une consistance gélatineuse. Il a été alors détaché de l’appareil, les oreillettes ont été retirées et les ventricules ont été dilacérés à l’aide de ciseaux. La réaction de digestion a été immédiatement stoppée par ajout d’un tampon d’arrêt (Stopping Buffer 1) composé de solution de perfusion contenant du CaCl2 12,5 µM et du sérum de veau nouveau-né 10% (Gibco). La dissociation finale du myocarde a été assurée par trituration douce à la pipette Pasteur. L’homogénat a été filtré sur une toile en nylon de 300 µm de seuil (Fisher Bioblock Scientific, Illkirch, France). Les cellules vivantes sédimentent par gravité après quelques minutes. Le surnageant a été éliminé et les cardiomyocytes ont été resuspendus dans un tampon (Stopping Buffer 2) composé de solution de perfusion additionnée de CaCl2 12,5 µM et de sérum de veau nouveau-né 5%. S’en suit une étape d’enrichissement en calcium qui a consisté à répéter l’opération suivante : aspiration du
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surnageant après sédimentation des cellules et ajout de Stopping Buffer 2 contenant des concentrations croissantes en calcium, à savoir, [µM] 62 ; 112 ; 212 ; 500 ; 1000.
Cardiomyocytes néonataux
Des souriceaux âgés de moins de 48 heures ont été euthanasiés par décapitation et les cœurs ont été prélevés après thoracotomie puis coupés en deux et rincés dans une solution froide de Hank’s balanced salt solution (HBSS, Gibco) pour éliminer un maximum de globules rouges. Les cœurs ont ensuite été digérés pendant 5 heures à 4°C sous agitation dans une solution de HBSS contenant 0,25% de trypsine et 1 mM d’acide éthylène diamine tétracétique (EDTA) (Gibco). La digestion enzymatique a été stoppée par addition de DMEM supplémenté en SVF (10%) et antibiotiques et préalablement chauffé à 37°C. Parallèlement, une solution de HBSS froid additionné de 0,1% de collagénase de type II (240 U/mg, Gibco) a été préparée, filtrée et répartie dans 5 tubes. Le surnageant du tube contenant les cœurs digérés par la trypsine a été éliminé et remplacé par le premier aliquot de collagénase 0,1%. La digestion par la collagénase a été effectuée à 37°C sous agitation et après 2 à 3 minutes, le milieu d’une apparence trouble du fait de la présence de cellules est collecté et mis de côté. Cette opération de digestion et de collecte a été répétée avec les 4 aliquots suivant de collagénase. Ce milieu renfermant les cellules a été centrifugé à 300 g pendant 5 minutes puis le culot a été resuspendu dans du DMEM supplémenté en SVF et antibiotiques. En parallèle, un gradient isotonique de percoll à 39% contenant 120 mM de NaCl a été préparé. Les cellules ont été déposées précautionneusement sur ce gradient puis le milieu a été centrifugé à 750 g pendant 30 minutes sans frein. Le culot contenant les cardiomyocytes a été rincé deux fois puis ensemencé en boîtes de culture. Après 20 minutes, les cellules flottantes ont été récupérées et mises en coculture alors que les cellules qui ont adhérées (majoritairement des fibroblastes) ont été éliminées.
Neurones de ganglions rachidiens
Le protocole a été adapté de Delree et al. (Delree et al. 1989). La souris a été anesthésiée par voie intrapéritonéale avec un mélange de 250 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine puis décapitée. La colonne vertébrale a été disséquée et placée dans une boîte de Pétri contenant du PBS puis découpée selon le plan sagittal. La moelle épinière a été retirée des deux demi-colonnes et les ganglions ont été prélevés et séparés de leurs racines. Les ganglions ont été digérés par une solution de collagénase D 0,5% (Roche Applied Science) pendant 30 minutes à 37°C sous agitation. La collagénase a été remplacée par une solution de trypsine 0,5% à 37°C sous agitation. La digestion
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enzymatique de 15 minutes a été stoppée par addition de DMEM supplémenté et centrifugation à 300 g pendant 10 minutes. Le culot a été resuspendu dans du DMEM supplémenté et la dissociation des ganglions par trituration mécanique a été réalisée par aspirations successives dans des pipettes Pasteur rodées de diamètre d'ouverture décroissant. Le matériel cellulaire non digéré a sédimenté et le surnageant a été récolté et mis en culture.