Les lignées cellulaires

La réplication du VHB est possible dans de nombreuses lignées cellulaires mais l’infection

par des particules virales in vitro n’est possible qu’avec la transfection de matériel génétique

sur les hépatocytes primaires humains, de Tupaïa belangeri et sur les cellules HepaRG (lignée

pro-génitrice hépatique bipotente) différenciées (Glebe et Urban, 2007 ;Taylor, 2013 ; Urban

et al., 2014).

Les lignées primaires hépatocytaires

Les hépatocytes primaires humains (PHH: Primary Human Hepatocyte) ont constitué pendant

vingt ans le seul modèle in vitro d’infection du VHB. Malgré des difficultés d’entretien,

c’était le seul moyen d’étudier le pouvoir infectieux. Elles sont obtenues à partir de pièces

hépatiques après résection chirurgicales (Xie et al., 2010). L’infection produite in vitro est

plutôt inefficace et ne dure que quelques jours. Celle-ci peut être améliorée en cas d’ajout de

Diméthylsulfoxide (DMSO) dans le milieu de culture et de polyéthylène glycol (PEG) au

cours de l’infection (Xie et al., 2010 ;Urban et al., 2014). Le PEG a la propriété d’augmenter

la fixation du VHB et VHD aux cellules, médiée par les GAGs (Urban et al., 2014).

Cependant, leur approvisionnement est limité et les prélèvements sont de qualité hétérogène

ce qui entraine une variation dans la sensibilité à l’infection. Il est donc difficile d’obtenir une

bonne reproductibilité (Xie et al., 2010 ; Urban et al., 2014). Mais du fait de la stricte

spécificité d’espèce de l’infection VHB, ce modèle le plus proche des hépatocytes humains

« normaux » demeure un système essentiel (Xie et al., 2010).

Les hépatocytes primaires issus de Tupaïa belangeri sont sensibles à l’infection par le VHB

(mise en évidence d’une réplication virale, expression des gènes et sécrétion d’Ag HBe puis

d’Ag HBs dans le milieu de culture). Ils sont obtenus plus facilement que les PHH et avec une

qualité plus homogène. L’infection est réalisable sans ajout de DMSO ou de PEG, et l’ajout

de DMSO dans le milieu de culture et de PEG au cours de l’infection, n’ont pas d’effet

significatif sur l’infection (Glebe, 2007 ; Xie et al., 2010 ; Urban et al., 2014).

Les lignées d’hépatome

La plupart de ces lignées sont dérivées de CHC ou d’hépatomes et sont très utilisées pour

étudier les différents aspects du cycle viral (Xie et al., 2010).

Les lignées HepG2 et Huh7 peuvent facilement répliquer l’ADN viral suite à la transfection

de plasmides codant tout ou une partie du génome viral (Xie et al., 2010). Cependant elles

n’expriment pas à leur surface le récepteur NTCP et ne sont donc naturellement pas sensibles

à l’infection par le VHB ou le virus de l’hépatite Delta (VHD). Le VHD est un virus défectif

qui nécessite l’enveloppe du VHB pour pouvoir infecter une cellule et se répliquer. Il est

communément admis que le processus d’entrée cellulaire est identique aux deux virus.

Cependant, le mode de réplication du génome du VHD est beaucoup plus simple et rapide que

celui du VHB. Il est donc souvent utilisé pour étudier les étapes précoces de l’entrée. Les

lignées HepG2 et Huh7 sont donc classiquement utilisées pour produire des particules virales

VHB ou VHD après transfection transitoire de plasmides codant le VHB (1.1 ou 1.3 unité de

génome) ou la ribonucléoparticule Delta et les protéines d’enveloppe du VHD.

Récemment, grâce à la découverte du NTCP comme récepteur spécifique du VHB, il est

possible de rendre sensible ces deux lignées à l’infection de VHB et de VHD en transfectant

un plasmide codant le hNTCP. Cependant, l’infection est efficace, comme pour les PHH, les

PTH et les HepaRG, seulement en présence de DMSO et de PEG (Xiao et al., 2013 ; Taylor et

al., 2013). Les taux d’infection annoncés dans la littérature sont aux alentours de 25 à 30 %.

(Yan et al., 2012 ; König et al., 2014). Les cellules hNTCP-HepG2 montraient les taux

d’infection les plus élevés (Watashi et al., 2014). Mais d’autres molécules que le hNTCP sont

requises pour le pouvoir infectieux du VHB (ou du VHD) et ces facteurs peuvent ne pas être

exprimés de façon équivalente entre les lignées transfectées Huh7,

hNTCP-transfectées HepG2 et HepaRG (Ni et al., 2014).

Par ailleurs, il existe des lignées avec intégration stable de VHB (HepG2.2.15 ou HepAd38)

qui sont utiles pour étudier les dernières étapes de la réplication virale et le screening des

antiviraux.

La lignée HepaGR correspond à un modèle plus récent. Il s’agit d’une lignée dérivée d’une

tumeur chez une femme souffrant d’une hépatite C chronique (Xie et al., 2010). Cette lignée

pro-génitrice hépatique est bipotente (Gripon et al., 2002). Elle devient permissive à

l’infection par le VHB ou le VHD après une différenciation cellulaire qui suit une longue

période d’induction avec du DMSO (deux semaines en présence de DMSO 2 %) et de

l’hydrocortisone (figure 27) (Gripon et al., 2002 ; Xie et al., 2010 ; Urban et al., 2014). C’est

l’une des lignées cellulaires hépatiques humaines des plus utilisées pour l’étude du pouvoir

infectieux du VHB. Les cellules HepaRG immatures peuvent aussi être transfectées à l’aide

d’un plasmide codant le hNTCP, mais avec des taux d’infection VHB inférieurs à ceux

mesurés pour les cellules hNTCP-HepG2. Au cours de la culture des PHH ou des PTH et au

cours de la différenciation des HepaRG, le DMSO permet l’induction et l’expression de

NTCP (Urban et al., 2014 ; Ni et al., 2014).

Figure 27 : Observation au microscope électronique de cellules HepaRG différenciées en

Remarque : Le virus de l’hépatite Delta (VHD)

Le virus de l’hépatite Delta (VHD) a été identifié pour la première fois en 1977 par l’équipe

de Mario Rizetto et al. Au sein d’une cohorte de patients infectés par le VHB présentant des

lésions hépatiques particulièrement sévères (Rizetto et al., 1977).

15 à 20 millions d’individus à travers le monde sont co-infectés par du VHB et du VHD, ce

qui représente 5 à 20 % des personnes infectées par le VHB (Alfaiate et al., 2015). L’infection

simultanée par les deux virus est associée à un risque accru d’hépatite fulminante. La

surinfection par le VHD d’un sujet porteur chronique d’une infection VHB se carractérise par

des lésions hépatiques plus sévères et une évolution plus fréquente vers la cirrhose.

La particule virale VHD mesure 35 à 37 nm de diamètre et contient un génome à ARN de

polarité négative, monocaténaire circulaire de 1672 à 1697 nucléotides. Il s’agit d’un virus

défectif utilisant l’enveloppe du VHB contenant les trois protéines S, M et L, pour pénétrer et

être excrété des hépatocytes. Cette particularité structurale lui confère le même tropisme

hépatocytaire que le VHB (Alfaiate et al., 2015). Contrairement au VHB, la protéine S seule

suffit à l’assemblage de la particule virale VHD mais dans ce cas, celle-ci n’est pas

infectieuse (Alfaiate et al., 2015).

L’infection par le VHB des hépatocytes est nécessaire à la réalisation du cycle viral VHD.

L’entrée du virus fait intervenir la fixation du domaine préS1 de la protéine L au récepteur

hNTCP, précédée d’un attachement des particules virales à la surface des hépatocytes via les

HSPGs (Alfaiate et al., 2015). Les réplications des deux virus sont ensuite parfaitement

indépendantes. La réplication du génome VHD est exclusivement nucléaire et s’effectue selon

un modèle de « double cercle roulant » faisant intervenir probablement des polymérases

cellulaires. Le génome du VHD code une unique protéine l’antigène Delta (Alfaiate et al.,

2015).

Le cycle de réplication viral du VHD étant plus simple que celui du VHB, de nombreux

modèles d’étude in vitro ont pu être établis, notamment grâce à la co-transfection de

plasmides codant la ribonucléoparticule Delta d’une part et les protéines d’enveloppe du VHB

d’autre part, dans des lignées cellulaires (HepG2, Huh7).

Dans le document Influence des protéines d’enveloppe du virus de l’hépatite B sur la disparition de l’antigène HBs circulant lors du traitement de l’hépatite chronique B par analogues nucléos(t)idiques : mécanismes moléculaires impliqués et développement d’un traitement i (Page 103-107)