1. Définition morphologique et moléculaire des NET.
Pour obtenir ces résultats, j’ai d’abord dû mettre au point l’ensemble des techniques utilisées pour ces expériences car rien n’avait été fait au laboratoire à ce sujet avant mon arrivée et celle de Patrice Decker, mon directeur. Il a fallu tout d’abord purifier les PNN de donneurs (sain ou patient PR), induire la formation de NET et définir ce qu’était un « NET ». Il existait de nombreuses photos de microscopie électronique de NET dans la littérature mais beaucoup moins en microscopie à fluorescence à l’époque. Les études publiées en 2012 décrivaient les NET comme des fibres dans lesquelles de l’ADN, des histones et une enzyme normalement contenue dans les granules, souvent la MPO, étaient colocalisés. Pourtant déjà, des groupes utilisaient le terme NET en microscopie à partir du moment où de l’ADN et la MPO étaient colocalisés même si la structure fibreuse n’était pas observée (cellules juste gonflées) (65,93). Pour être le plus rigoureux possible nous avons appelé NET une structure fibreuse composée de chromatine (ADN + histones) observée en microscopie à fluorescence (Figure 3). Nous avons en parallèle testé un grand nombre de stimuli susceptibles d’être impliqués dans la PR (ligands TLR, cytokines) et susceptibles d’induire la formation de NET mais seul le PMA nous a permis d’observer les structures précédemment décrites. Néanmoins, même si nous n’avons pas utilisé d’inducteurs naturels, les NET induits par PMA permettent de mimer le processus physiologique. Nous n’avons donc pas retrouvé les résultats décrits par le groupe de Kaplan (75). Celui-ci a rapporté que l’IL-17 pouvait induire la formation de NET, pourtant il a été rapporté que les PNN n’exprimaient pas le récepteur fonctionnel à l’IL-17(35). De plus Khandpur a utilisé pour mesurer la formation de NET dans ses expériences, le Sytox Green en condition de culture, c'est-à-dire directement dans le milieu avec les cellules, estimant que seuls les NET seraient marqués. Donc, il est impossible de vérifier si la
fluorescence est due réellement à des NET (structure fibreuse de chromatine extracellulaire). La fiche technique du Sytox indique qu’il entre dans la cellule à partir du moment où l’intégrité des cellules est modifiée, d’ailleurs ce produit à été conçu pour mesurer la viabilité cellulaire. Il y a donc une possibilité que Kaplan ait mesuré l’apoptose ou la nécrose des cellules bien que le temps de culture employé soit court (1 heure). De la même façon, l’équipe de Niess a rapporté la libération de « NET » (ADN libre) dans la circulation sanguine après un effort intense. Cependant le résumé de l’étude ne fait pas référence à une mesure de la mortalité des cellules après un tel effort(77).
2. Les IgG ACPA+ lient les NET
Nous avons ensuite utilisés les immunoglobulines G purifiées de patients atteints de maladies rhumatologiques. Les IgG des patients testés positifs pour les ACPA ont été mélangées (ACPA+) et les IgG de patients ne contenant pas d’ACPA ont été mélangées dans un autre groupe (ACPA-). Les NET ont ensuite été marqués grâce à ces immunoglobulines et à un anticorps de chèvre anti-humain conjugué à un fluorochrome (canal rouge). Nous avons donc pour ces expériences un réel contrôle négatif. Nous avons aussi utilisé un deuxième contrôle : le marquage avec des IgG purifiées de donneurs sains. Ce marquage s’est révélé systématiquement négatif. Pour comparer les intensités de fluorescence, nous nous sommes focalisés uniquement sur les structures fibreuses composées d’ADN. Cette évaluation était plutôt qualitative puisque nous n’avons pas pu effectuer la quantification automatique publiée par Brinkmann(93). Pour ne pas biaiser les observations, les champs ont été choisis dans le canal vert de l’ADN(impossible de savoir si la structure a été marquée par les IgG ou non) puis la photo a été prise en vert puis en rouge. Les photos ont été analysées en aveugle par deux personnes. Les réglages d’exposition et d’amélioration des contrastes ont été les mêmes pour tous les donneurs traités. Vingt-six donneurs ont été testés, 10 sains, 16 PR. 19 expériences étaient exploitables (présence de NET) et nous avons obtenu 15 expériences (79%, 8 sains, 7 PR) pour lesquels le marquage avec des IgG ACPA+ était plus fort que le marquage IgG ACPA- sur les NET. En cytométrie en flux nous avons montré que le marquage sur des neutrophiles intègres était faible et identique avec les IgG normales, les IgG ACPA+ ou les IgG ACPA-. Ainsi, nous avons confirmé que le marquage plus fort sur les NET avec les IgG ACPA+ était bien spécifique de ces structures.
B. Les NET sont immunogènes.
L’étape suivante était de montrer que les NET sont immunigènes après avoir démontré que les ACPA s’y fixent spécifiquement. Les techniques employées pour induire les NET et les marquer n’étaient pas directement utilisables pour les tests fonctionnels puisque pour le marquage les NET sont fixés au paraformaldéhyde (PFA). Le PFA résiduel peut aussi avoir un effet nocif pour les cellules en culture. J’ai donc dû adapter les protocoles. Nous avons choisi d’utiliser des NET solubles, c'est-à-dire détachés de leur PNN (et du plastique), pour effectuer les tests fonctionnels. Ainsi nous nous libérons des problèmes engendrés par le PFA et les éventuels produits de culture qui pourraient rester dans le support (PMA, cytokines). Nous avons en effet constaté que ces derniers activaient les cellules cibles ajoutées.
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
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1.
Les NET solubles
Pour obtenir des NET solubles, il faut les détacher des PNN qui les ont formés. Pour cela certains utilisent la force d’un simple pipetage ; nous avons choisi d’utiliser la DNase I pour détacher les NET. Pour ne pas dégrader complètement les NET, il a fallu calibrer la digestion. Cette méthode a aussi l’avantage de permettre la préparation d’un tampon qui ne contient pas de NET et qui représente un bon contrôle négatif. Pour obtenir des NET solubles, les PNN sont ensemencés à forte densité, la NETose est induite par le PMA et les NET digérés faiblement avec de la DNase. La réaction est stoppée avec de l’EDTA. En contrôle, la même procédure est effectuée sans ensemencer les PNN mais toujours avec l’utilisation de PMA, de DNase et d’EDTA. Ce contrôle est nécessaire car le tampon contenant la DNase pourrait avoir un effet direct sur les macrophages ou les PNN. Il contient en effet du calcium nécessaire à l’activité de la DNase mais il contient aussi de l’EDTA qui peut empêcher l’activation des cellules. L’équipe de Chollet-Martin n’utilise pas la DNAse I pour solubiliser les NET(90) car il semblerait que cette méthode ne leur permette pas d’obtenir de NET immunogènes. Et pour cause, la réaction de digestion n’est apparement pas stoppée avec de l’EDTA et donc il est possible que les NET soient complètement dégradés lorsqu’ils sont mis en culture (et donc non fonctionnels). Le même raisonnement est à tenir avec la nucléase micrococcale. L’équipe de Chollet-Martin utilise en revanche une enzyme de restriction : Alu I, qui ne nécessite pas d’arrêt de réaction puisqu’elle coupe selon des séquences nucléotidiques précises(90). Lorsqu’il n’y a plus de site disponible, la digestion s’arrête. Ainsi ce groupe obtient des fragments de NET de grande taille qui selon eux, sont les plus immunogènes. Cette équipe n’utilise en revanche pas le tampon enzymatique en contrôle. Les NET solubles que nous obtenons sont qualifiés biochimiquement et quantifiés afin d’utiliser différentes préparations de NET mais relativement uniformes. Initialement nous souhaitions utiliser en contrôle négatif (absence de NET), des PNN activés par le PMA mais dont la NETose a été inhibée par inhibiteurs classiques décrits : DPI, NAC, Chlore- Amidine. Ce contrôle n’a pas été concluant car ces inhibiteurs ont une efficacité médiocre excepté pour DPI. La formation de NET n’était pas totalement inhibée avec NAC et Chlore- Amidine. Ceci a été vérifié par immunofluorescence et par la concentration en NET soluble. Le DPI quant à lui inhibe effectivement totalement la formation de NET mais il inhibe aussi totalement l’activation des PNN (vérifié par ELISA). Il est donc logique de ne pas voir de NET. Les résultats publiés par Marcos sont donc à prendre avec précautions d’autant plus que certains résultats ont été rétractés (76), cet inhibiteur de la NOX n’est donc pas spécifique de la formation de NET. De notre coté nous avons fait le choix de ne pas utiliser ce témoin.
2.
Les NET ont un effet pro et anti-inflammatoire à la
fois.
Grâce aux NET solubles de donneurs sains ou de patients PR que nous avons préparés, nous avons pu montrer que ceux-ci activent d’une part les macrophages mais aussi les PNN. En effet, les NET entrainent la libération d’IL-8, plus rarement de TNF par les macrophages et d’IL-8 par les PNN. Afin de vérifier que les cytokines mesurées après culture des PNN ou macrophages ne soient pas issues de la mixture qui contient les NET, j’ai dosé systématiquement les cytokines provenant des NET solubles. Les quelques expériences où la présence de cytokine a été détectée dans les NET n’ont pas été prises en compte. Les NET
ont donc un effet activateur sur les macrophages et PNN. En revanche, lorsque les macrophages sont activés par du LPS et mis en présence de NET, la sécrétion d’IL-6 et de TNF est diminuée par rapport aux macrophages activés par le LPS sans présence de NET. Ces résultats corroborent ceux rapportés par Barrientos sur les DC(118), cependant cette équipe n’avait pas vu l’effet direct des NET sur de telles cellules. D’après cette équipe, l’effet inhibiteur des NET serait dû aux molécules présentées par les NET. Cette hypothèse doit être vérifiée par des études complémentaires. Nous avons aussi cherché à démontrer que les IgG ACPA+ liées aux NET pouvaient rendre les NET davantage immunogènes. Cependant bien que les IgG ACPA+ se fixent aux NET, nous n’avons pas pu démontrer un effet additionnel des IgG ACPA+ sur l’activation des macrophages ou des neutrophiles. Par contre, nos résultats suggérent que les TLR endosomaux ne sont pas impliqués dans la reconnaissance des NET puisque l’inhibition de l’acidification des endosomes n’altère pas l’activité des NET.
3.
C1q module l’effet immunogène des NET.
C1q a été décrit comme interagissant avec les NET mais des rôles contradictoires ont été décrits (115,117). Nous avons donc cultivé des NET et des cellules en présence de C1q. De plus, les PNN et les macrophages expriment des récepteurs au C1q. Nous avons pu constater que C1q augmente les effets des NET sur la sécrétion d’IL-8 par les macrophages. Mais C1q semble inverser l’effet des NET sur la sécrétion de TNF par les macrophages activés avec le LPS sans influencer l’IL-6 (données non montrées). C1q module donc l’effet des NET sur les macrophages. En effet, les NET seuls inhibent la sécrétion de TNF par les macrophages activés par le LPS mais en présence de C1q les NET n’inhibent plus cette sécrétion. Il y donc une interaction NET/C1q qui modifie la nature immunogène des NET. Dans un contexte inflammatoire local, par exemple dans l’articulation, il peut y avoir présence conjointe de NET et de C1q. L’interaction de ces deux partenaires pourrait engendrer une augmentation de l’inflammation par activation des PNN et macrophages tous présents dans les articulations de patients PR. Nous allons vérifier cette hypothèse, en injectant de façon systémique et locale, des NET à des souris qui n’expriment pas C1q comparées à des souris normales. Et grâce à notre expertise sur l’arthrite au collagène, nous allons aussi pouvoir vérifier cette hypothèse dans le contexte l’inflammation articulaire. Ainsi nous pourrons confirmer que les NET associés à C1q sont responsables, au moins en partie, de l’inflammation locale dans l’AEC. Cette expérience permettrait aussi de vérifier le rôle des NET in vivo dans la rupture de la tolérance dans un modèle animal d’arthrite et l’induction d’auto-anticorps.
Enfin, d’après des résultats récents que nous avons publiés, le TLR9 exprimé à la surface des PNN, pourrait être un des récepteurs activables par les NET. Ce point est en cours d’investigation.
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
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