Les prolongements d’IS et les diversités transcriptomiques inter-souches

La diversité des génomes entre les différentes souches de Bordetella pertussis serait en lien avec les remaniements des génomes provoqués par les IS, en particulier par les IS481 présentes en grand nombre (Brinig et al., 2006; Heikkinen et al., 2007). Un exemple marquant est la comparaison des génomes des souches de Bordetella pertussis avant et après l’ère vaccinale dans les pays développés (Xu et al., 2015). Les prolongements de transcription étant observés pour presque la totalité des IS, la formation d’ARN messagers et de candidats ARN régulateurs issus de ces IS pourrait, elle aussi, varier entre différentes souches du pathogène en fonction de l’organisation génomique induite par les remaniements.

i. La diversité de localisation génomique des IS481

Pour déterminer l’impact global des IS481 sur l’architecture du transcriptome, la position et le nombre d’IS481 a été comparé entre 21 souches de Bordetella pertussis entièrement séquencées et annotées (Matériel et Méthode 17). Les IS481 sont retrouvées en plus de 230 copies pour chaque souche analysée (Tableau 7A). Cependant, ce nombre varie d’une souche à une autre, allant de 236 copies pour la souche 18323 à 260 copies pour la souche VA-190.

Les différences de localisation génomique entre les 21 souches ont été déterminées en comparant les séquences du départ de transcription des Pout jusqu’à 200 nucléotides en aval de l’extrémité de l’IS (Matériel et Méthode 17). Certaines localisations d’IS481 sur le génome sont spécifiques de certaines souches (Tableau 7B). Par exemple, il existe 9 positions d’IS481 spécifiques sur le génome de la souche de référence Tohama I (Colonne) par rapport au génome de la souche D420 (Ligne), souche représentative des souches circulantes. A l’inverse, il existe 15 positions d’IS481 spécifiques sur le génome de la souche D420 (Colonne) par rapport au génome de la souche Tohama I (Ligne).

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Certaines souches montrent très peu de disparités en terme de localisation d’IS481, comme les souches D420 et B1917, deux souches circulantes, où seulement 4 localisations d’IS481 sont spécifiques de la souche D420. Cependant, d’autres souches montrent des disparités plus importantes, comme la souche circulante 18323 qui Tableau 7: Répartition des IS481 chez 21 souches séquencées de Bordetella pertussis. (A) : Nombre d’IS481 retrouvées dans chaque souche séquencée. (B) : Nombre de localisations d’IS481 spécifiques entre les souches. Les nombres correspondent aux positions spécifiques retrouvées dans la souche nommée en colonne par rapport à la souche nommée en ligne. Voir exemple de lecture dans le texte.

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présente plus de 70 localisations d’IS481 spécifiques en comparaison des 20 autres souches.

Les différences de position et de nombre d’IS481 sont le reflet de la diversité génomique des souches de Bordetella pertussis. Les divergences génomiques de la souche Tohama I avec les souches cliniques B1917, D420, CS et 18323 ont été étudiées à l’aide du logiciel Mauve (Figure Supplémentaire S5) (Darling et al., 2004). Malgré un génome plus proche de celui de la souche CS que de D420 et B1917, le nombre et les localisations spécifiques des IS481 dans Tohama I est comparable pour les 3 souches. Le génome de la souche Tohama I semble cependant très éloigné de celui de la souche

Figure 33 : Validation des variations de prolongements de transcription issues de Pout orientés en antisens des gènes en aval entre les souches BpSM et D420.

Les séquences ont été alignées sur les génomes des souches BpSM et D420 avec le logiciel CLC Genomics Workbench v10. La profondeur de séquençage en rouge de séquences alignées sur le brin négatif est en rouge, sur le brin positif en vert, et sur les régions répétées en jaune. Pour les RT-PCR, les ADNc ont été générés avec l’amorce antisens du transcrit (Rc), et amplifiés avec le couple Fc/Rc pour détecter le transcrit, et le couple Fis/Rc pour détecter le prolongement de transcrit issu du Pout. Flèche Rouge : Annotation des IS481. Flèche bleue : Annotation des gènes. Flèche noire : Promoteurs. Flèche orange : Transcrits. T- : Témoin négatif de PCR. T+ et IST+ : Témoin positif de PCR de la région génomique (Fc/Rc) et de la région de l’IS (Fis/Rc). L : Marqueur de taille. AS : PCR avec Fc/Rc. IS : PCR avec Fis/Rc. RT T- : Témoin négatif de RT.

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18323, en comparaison avec les autres souches. Ces divergences génomiques illustrent l’activité des IS481 et des remaniements génomiques possibles. Elles pourraient de ce fait expliquer les divergences de localisation génomique spécifique des IS481 entre les différentes souches de Bordetella pertussis.

ii. La diversité transcriptomique des IS481 inter-souche

La localisation génomique spécifique de certaines IS481 chez différentes souches de Bordetella pertussis pourrait générer des divergences transcriptomiques des prolongements de transcription issus de ces IS. Pour valider les diversités transcriptomiques entre différentes souches du pathogène, les ARN totaux de la souche D420 cultivée en condition classique de culture (en phase Bvg+_{) ont été séquencés} (Matériel et Méthode 4). Les prédictions de prolongements de transcription issues des IS481 ont été comparées aux localisations génomiques spécifiques des IS481 entre les souches D420 et BpSM, souche dérivée de Tohama I résistante à la streptomycine.

Figure 34 : Validation des variations de prolongements de transcription issus de Pout orientés en sens des gènes en aval entre les souches BpSM et D420.

Les ADNc ont été générés avec une amorce antisens de l’ARNm de smpB (Rs), et amplifiés avec le couple d’amorces Fs/Rs pour vérifier la transcription du gène, et le couple d’amorce Fis/Rs pour tester la transcription de l’ARNm par le prolongement de transcription issue du Pout. La légende de la figure est identique à celle décrite en figure 33.

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Parmi les 9 localisations génomiques spécifiques de la souche Tohama I, seules 3 IS481 montrent des prolongements de transcrit issus de Pout, 2 sont orientés en sens de gènes pour transcrire un ARNm et un transcrit est orienté en antisens du gène en aval. De la même manière, parmi les 15 localisations génomiques spécifiques de la souche D420, 9 IS481 montrent des prolongements de transcription issus de Pout, 5 d’entre eux se prolongent en sens des gènes en aval, et 4 en antisens des gènes.

Un antisens du gène tgt, codant pour une ARNt rybosyltransférase, a été validé par RT-PCR (Figure 33). Cet ARN est transcrit par le Pout de l’IS481 localisée en aval du gène tgt et est spécifique de la souche BpSM, aucune IS481 n’étant présente en aval de ce gène chez la souche D420. De la même façon, le transcrit du gène smpB, codant pour une protéine liant l’ARN messager-transfert, est transcrit chez les deux souches et a été validé par RT-PCR (Figure 34). Cependant, l’ARNm de smpB est transcrit à la fois par son propre promoteur, et par le Pout d’une IS481 localisée en amont du gène chez la souche D420, absent chez la souche BpSM.