II. Mise en évidence des ARN régulateurs indépendant
3. Discussion : Un complexe de régulation encore inexploré
L’étude du transcriptome primaire de Bordetella pertussis en phase Bvg+ a permis
d’établir une liste exhaustive d’ARN régulateurs potentiels. Un total de 978 prédictions d’ARN régulateur a été prédit par le cumul de trois approches prédictives, se basant sur le séquençage du transcriptome et sur l’identification de séquences stables et non annotées, et contiennent un taux de 70% de vrais-positifs. La combinaison des approches biologiques et bioinformatiques recouvrent un nombre de prédictions similaire à celles retrouvées chez d’autres pathogènes, notamment chez Clostridium difficile, chez qui 511 ARN régulateurs ont été prédits par des approches bioinformatiques, et 251 retrouvés par séquençage à ARN différentiel (Beauregard et al., 2013; Papenfort et al., 2015; Soutourina et al., 2013; Toledo-Arana et al., 2009).
Dans la liste d’ARN candidats issus de mon travail, 175 pourraient être de longs 5’UTR de gènes codant, correspondant potentiellement à des riboswitches ou des thermosenseurs discutés dans le premier chapitre de cette étude, dont un nouveau long 5’UTR a été validé par RT-PCR. Cependant, d’autres prédictions d’ARN régulateurs sont localisées au niveau des prolongements de transcription issus d’ARN ribosomiques et d’ARN de transfert. Ces prolongements correspondent à des espaceurs, clivés et rapidement dégradés pendant le processus de maturation, mais il a été montré très récemment que certains de ces espaceurs externes et internes peuvent agir comme une éponge à ARN (Lalaouna et al., 2015). Le 3’ETS du précurseur polycistronique glyW-cysT- leuZ chez Escherichia coli peut s’hybrider avec les ARN RyhB et RybB pour inhiber une action trop importante de ces régulateurs. Chez Bordetella pertussis également, les prédictions correspondant aux espaceurs internes et externes d’ARN de transfert pourraient agir comme des éponges à ARN régulateurs pour limiter leur action.
De la même façon, 144 prédictions sont localisées au niveau des 3’UTR d’ARN messagers, dont 4 ont été validés par Northern Blot. Récemment, il a été montré que ce genre d’ARN régulateurs était soit issu du clivage de l’ARN messager, classé comme ARN régulateur en 3’UTR de type I, soit transcrit par un promoteur localisé dans la séquence codante du gène en amont, classé alors comme ARN régulateur en 3’UTR de type II (Chao et al., 2012; Miyakoshi et al., 2015a; Ren et al., 2017; Svensson and Sharma, 2016). Ces ARN régulateurs agissent en trans et sont stabilisés par l’hexamère Hfq, ce qui serait le cas de BPnc425, BPnc451 et BPncX01 (Guo et al., 2014; Miyakoshi et al., 2015b). Ces trois prédictions, validées par Northern Blot, sont déstabilisées en absence du polymère Hfq. L’absence de TSS pour BPnc451 indique qu’il serait un transcrit de type I, issu du clivage de l’ARNm du gène ptpA codant pour une tyrosine-phosphatase. Ces protéines sont régulièrement impliquées dans la transduction du groupement phosphate des systèmes à deux composants, et également impliquées dans la réponse aux stress et dans la virulence de certains pathogènes (Caselli et al., 2016; Musumeci et al., 2005). A l’inverse, des TSS ont été prédits pour BPnc425 et BPncX01, deux ARN ayant un profil vrg, transcrits en 3’UTR de type II. Ces deux transcrits sont localisés en 3’UTR des gènes les plus fortement exprimés en phase Bvg- (Coutte et al., 2016). Leurs localisations pourraient suggérer une implication dans la réponse aux stress, comme l’ARN régulateur
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MicL chez Escherichia coli régulant négativement la synthèse de lipoprotéines pour éviter les tensions de l’enveloppe et qui est transcrit en 3’UTR de cutC, impliqué dans la réponse aux excès de cuivre (Guo et al., 2014; Miyakoshi et al., 2015a). L’opéron BP1736-BP1737-BP1738 étant potentiellement impliqué dans la réponse au stress osmotique, BPnc425 pourrait avoir une fonction parallèle à celle de l’opéron.
Un grand nombre d’ARN régulateurs prédits sont localisés dans des régions intergéniques, agissant potentiellement en « trans ». Les ARN régulateurs transcrits dans ces régions sont en général stabilisés par l’hexamère Hfq, facilitant également l’appariement avec leur cible (Brennan and Link, 2007; Kim et al., 2015; Vogel and Luisi, 2011). Chez Bordetella pertussis, il a déjà été montré que ce polymère était impliqué dans la virulence du pathogène, et plus particulièrement dans la régulation du système de sécrétion de type III, un facteur de virulence majeur nécessaire à la persistance de l’infection chez la souris (Bibova et al., 2013, 2015; Melvin et al., 2014). La perte de
virulence en absence de l’hexamère Hfq en phase Bvg+ pourrait impliquer l’action d’ARN
régulateurs prédits dans notre liste de candidats. Ces ARN potentiellement impliqués dans la régulation de la virulence du pathogène pourrait être également modulés en fonction de l’état d’activation du phosphorelai BvgAS. Les différences de prédictions identifiées en fonction de l’état de virulence du pathogène pourrait amener à la découverte d’ARN impliqués dans la régulation de la virulence du pathogène. La comparaison des départs de transcription en phase Bvg+ et Bvg- a ainsi permis d’identifier 12 prédictions à profil vag, et 6 prédiction à profil vrg.
Le transcriptome bactérien est, en général, constitué de nombreux ARN antisens naturels (Brantl, 2007; Inouye, 1988; Lasa et al., 2012). L’étude du transcriptome primaire de Bordetella pertussis a permis d’identifier 381 prédictions d’ARN régulateurs orientés en antisens des gènes annotés. Parmi ces ARN, 6 antisens de gènes majeurs de virulence ont été validés par Northern Blot. Les ARN transcrits en antisens de gènes ont généralement un rôle d’inhibiteur, soit en altérant la stabilité de l’ARN messager par recrutement de RNases, soit par un blocage de la séquence de fixation du ribosome, ou soit par la formation d’un terminateur précoce de transcription (Brantl, 2007; Chang et al., 2015; Georg and Hess, 2011; Inouye, 1988; Pinel-Marie et al., 2014). BPnc180, antisens du gène cyaA, codant pour la toxine hémolytique du pathogène, est localisé en
5’ de l’ARN messager et est exprimé uniquement en phase Bvg+. La séquence s’appariant
avec la séquence codante du gène, il pourrait avoir un rôle de déstabilisateur. L’antisens de dnt, BPnc838, localisé à l’extrémité 3’, pourrait jouer un rôle similaire, proche des systèmes de toxine-antitoxine connus (Brantl and Jahn, 2015; Pinel-Marie et al., 2014). Enfin, les antisens des adhésines fhaB, fimB et fim3 sont également localisés en 5’ de la séquence codante. Ces ARN régulateurs potentiels ont été prédits comme étant modulés en fonction de l’état de virulence du pathogène. Ils seraient donc régulés par le système à deux composants BvgAS, et souligneraient un nouveau système de régulation de l’expression des toxines et adhésines du pathogène.
Les ARN régulateurs permettent à la cellule de s’adapter rapidement aux changements environnementaux (Svensson and Sharma, 2016). L’induction d’un stress
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causé par un changement environnemental serait en lien avec des changements d’expression d’ARN régulateurs (Kopf et al., 2015). De ce fait, l’expression de ces transcrits pourrait varier d’une souche à une autre au sein de la même espèce. Les remaniements génomiques causés par la pression vaccinale chez Bordetella pertussis pourraient également altérer l’expression de certains de ces ARN régulateurs (Brinig et al., 2006; Sealey et al., 2016).
Parmi la liste de candidats régulateurs, 72 prédictions seraient issues des prolongements de transcription provenant des IS481. L’impact de ces prolongements de transcription des IS481 sur le transcriptome primaire de Bordetella pertussis a été analysé. Un de ces candidats ARN régulateur, BPnc264, orienté en antisens du 3’ de la séquence codante de fim2, prendrait son origine dans l’IS481 BP1118 localisée en aval du gène. L’étude de l’impact des prolongements de transcription des IS481 et l’étude de BPnc264 font l’objet des prochains chapitres de cette thèse.
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