Discussion : Architecture et régulateurs non-indépendants

Le couplage du séquençage à ARN profond et du séquençage à ARN différentiel a permis d’établir l’architecture globale du transcriptome primaire de Bordetella pertussis

en condition Bvg+_{. Le nombre de TSS et de gènes annotés révèle une architecture dans}

laquelle la majorité des gènes sont exprimés, incluant certaines séquences d’insertion, Figure 24: Validation du chevauchement des transcrits de bvgAS et de bvgR par RT-PCR.

L’annotation du transcriptome primaire a prédit un chevauchement des extrémités 3’ des deux transcrits (Haut). La validation du chevauchement par RT-PCR suit le même plan qu’en figure 21. Rapidement, les transcriptions inverses ont été faites avec les amorces Rt (3’UTR) et Rg (Gène annoté) et amplifiés avec les amorces Fg/Rg (Gène annoté, ligne 1), Ft/Rt (3’UTR, ligne 2) et Fg/Rt (Test de prolongement, ligne 3).

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et des structures régulatrices potentielles qui n’étaient pas encore détaillées chez le pathogène de la coqueluche. La mise en évidence de 2722 TSS, dont certains ont été validés par 5’RACE, et de 1315 structures validés par RT-PCR pour nombre d’entre elles ont permis de recouvrir l’architecture de 2262 gènes annotés sur 3871. La co- transcription de l’opéron de la toxine pertussique avec l’ARN de transfert BPt51, possédant l’anticodon GTT, nécessaire à l’incorporation de Valine, pourrait définir un autre niveau de régulation. Chez d’autres bactéries, l’usage des codons régule la quantité de protéines, leur sélection et leur exportation dans le milieu extracellulaire (Korkmaz et al., 2014; Ran et al., 2014). L’ARN de transfert valine possédant l’anticodon GTT serait surexprimé en phase Bvg+_{, la toxine pertussique étant un gène de classe I} (Melvin et al., 2014). Ce codon pourrait être utilisé principalement pour les gènes tardifs de virulence de classe I, co-exprimés avec la toxine pertussique.

La majorité des ARN mono- et polycistroniques présentent des structures régulatrices prédites en 5’ ou en 3’ de ces transcrits. Ces éléments de régulation pourraient également être affectés par les remaniements chromosomiques induits par les IS481, comme cela l’a déjà été montré pour l’expression des gènes (Brinig et al., 2006). La description du transcriptome primaire a révélé un réseau de régulation potentiel très complexe comme cela a déjà été observé chez d’autres procaryotes. Cette complexité du réseau de régulation pourrait être en lien avec la pathogénicité et l’efficacité de ces pathogènes (Sharma et al., 2010; Stazic and Voß, 2016). Certains ARN messagers sont transcrits au départ du codon d’initiation de la traduction, appelés ARN messagers « leaderless », représentant 0,90% de la totalité des gènes annotés. Ces gènes correspondent en majorité à des régulateurs transcriptionnels chez Bordetella pertussis, dont nombre d’entre eux codent pour des protéines de type HU, capables de lier l’ADN. La surreprésentation de cette catégorie de gènes a déjà été observée chez Deinococcus deserti et Deinococcus radiodurans, ils sont essentiels pour la survie de ces espèces en environnement extrême (Bouthier de la Tour et al., 2015). L’absence de site de fixation du ribosome remet en question notre paradigme du mécanisme traductionnel des ARN messagers, ceux-ci sont traduits à partir d’extrémités 5’ AUG phosphatées, reconnues directement par le ribosome chez Escherichia coli (Brock et al., 2008; Giliberti et al., 2012). Il a été montré que ces transcrits peuvent être régulés, transcrits et traduits en réponse à un stress, ou en fonction de la disponibilité des protéines impliquées dans la machinerie traductionnelle (Moll et al., 2002; Vesper et al., 2011). La majorité de ces ARN codant pour des régulateurs transcriptionnels, il se pourrait que ces ARN messagers « leaderless » soient traduits peut être moins efficacement que les ARN messagers canoniques, mais de façon plus fidèle pour répondre efficacement à un stress environnemental (Kozak, 1991; Malys and McCarthy, 2011; Moll et al., 2002; O’Donnell and Janssen, 2001).

A l’opposé des ARN messagers « leaderless », plusieurs transcrits mono- et polycistroniques présentent des 5’UTR supérieurs à 100 nucléotides. Certaines de ces structures correspondent à des prédictions de riboswitches, validés pour nombre d’entre eux par RT-PCR. Certains de ces riboswitches peuvent lier des co-facteurs enzymatiques (SAM, SAH, FMN, TPP et Cobalamine), permettant à la cellule de s’adapter

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rapidement à la production où la quantité de ces facteurs présents dans l’environnement (Oliva et al., 2015; Pedrolli et al., 2015; Polaski et al., 2016). D’autres de ces riboswitches peuvent lier des acides aminés, comme la glycine, ou encore les ARN de transfert, pour réguler les composants de la machinerie traductionnelle (Grundy and Henkin, 1993; Hot et al., 2011). Le riboswitch prédit du gène thrS a déjà été mis en évidence chez Bacillus subtilis, permettant de limiter la production d’ARNt ligase en absence de tyrosine. Enfin, un autre riboswitch, yybP-ykoY, peut lier les ions métalliques, comme le manganèse (Dambach et al., 2015). Les ions sont considérés comme un des éléments essentiels pour l’infection chez les pathogènes, et notamment chez Bordetella pertussis (Beall, 1998; de Gouw et al., 2011). L’adaptation rapide à la quantité de métaux et de cofacteurs peut être un élément de régulation supplémentaire, encore non documenté, nécessaire à différentes étapes de l’infection du pathogène. La caractérisation du transcriptome primaire n’a, cependant, pas permis de prédire des thermosenseurs, structures activant ou inhibant la transcription ou la traduction de gènes en aval en fonction des changements de température, un attrait important dans la virulence du pathogène (Dupré et al., 2015, 2013). La détection de ces thermosenseurs nécessiterait des études transcriptomiques approfondies sur des cellules cultivées à différentes températures. Cependant, parmi la détection des 120 longs 5’UTR supérieurs à 100 nucléotides à 37°C, plus 10 d’entre eux ne sont pas prédits comme des structures antisens ou des riboswitches. Il est possible que ceux-ci correspondent à d’autres structures régulatrices, notamment à des thermosenseurs potentiellement impliqués dans les étapes de l’infection de l’hôte.

Une large proportion des ARN mono- et polycistroniques se prolongent en antisens des gènes environnant, par leur extrémité 5’ ou leur extrémité 3’. Les 5’UTR chevauchant en antisens de deux gènes résultent en une compétition d’expression. Le degré d’activation de ces gènes va permettre, en fonction des changements environnementaux, d’exprimer uniquement l’un ou l’autre de ces gènes. Cette définition s’applique également à l’excludon BP1203, recouvrant entièrement la séquence de BP1202, un régulateur transcriptionnel de la famille TetR. Ces deux gènes auraient, selon cette définition, des fonctions opposées, phénomène déjà observé pour la régulation des flagelles chez Listeria monocytogenes (Sesto et al., 2013; Wurtzel et al., 2012). Le 5’UTR du gène codant pour MogR, le répresseur de la motilité, est transcrit en antisens des deux premiers gènes de l’opéron codant pour le flagelle. Différentes familles de gènes présentent des 5’UTR orientés en antisens des gènes environnant chez Bordetella pertussis, reflétant un réseau de régulation complexifié par des compétitions de niveau d’expression de gènes de fonctions opposées.

La majorité des transcrits antisens détectés provient des 3’UTR issus des ARN mono- et polycistroniques, se prolongeant jusqu’à plus de 400 nucléotides en aval de certains d’entre eux. Ce système de régulation serait également un système de répression entre deux gènes de fonctions potentiellement opposées (Brantl, 2007; Lasa et al., 2012; Thomason and Storz, 2010). Plusieurs prolongements de transcrits en 3’ ont été mis en évidence en déterminant le transcriptome primaire, certains sont impliqués dans la virulence de Bordetella pertussis. L’un des exemples les plus frappants concerne le

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principal régulateur de la virulence, le système à deux composants BvgAS. Le prolongement de transcription des gènes bvgAS et bvgR pourrait ajouter un nouveau niveau de régulation de l’expression du phosphorelai et de la virulence du pathogène. L’expression de BvgR étant modulée par BvgA phosphorylé pour catalyser le cyclique di- GMP en GMP, la phosphorylation de l’activateur transcriptionnel activerait la transcription de bvgR, se prolongeant en antisens, entrainant une boucle de rétrocontrôle potentielle de l’expression de bvgAS dépendant de l’activation de facteurs sigma. Les transcrits antisens pourraient de ce fait jouer un rôle fondamental lors des différentes étapes de l’infection.

L’analyse du transcriptome primaire de Bordetella pertussis en condition Bvg+ _a permis d’identifier de nouvelles structures régulatrices non-indépendantes issues de prolongements des ARN messagers sur leurs extrémités 5’ et/ou 3’. Le remaniement du génome du pathogène induit par les IS481 pourrait altérer l’expression de ces structures régulatrices et potentiellement affecter la régulation des gènes de virulence et altérer l’expression des antigènes utilisés dans le vaccin acellulaire. Les diversités génomiques inter-souches se reflètent également dans la diversité du transcriptome non codant régulateur (Kopf et al., 2015). Elle concerne principalement une catégorie majeure de transcrits, les ARN régulateurs indépendants, majoritairement non codants (Svensson and Sharma, 2016). Le transcriptome primaire de Bordetella pertussis a donc été analysé également dans le but d’identifier des ARN indépendant et potentiellement régulateurs.

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