Les peptides de la famille du MIF (Melanocyte Inhibiting Factor)

Le MlF-1 (Pro-Leu-Gly-NH2) est le tripeptide carboxy-terminal de l’ocytocine, dont il provient à la suite de coupures successives de liaisons peptidiques par une exopeptidase. Il est pourvu de certaines propriétés anti-opioïdes, comme d’autres peptides de structure apparentée Tyr-MlF-1 et Tyr-W-MIF-1, également présents dans le système nerveux central, mais qui ne sont pas issus du précurseur de l'ocytocine. Ces peptides :

- réduisent l’analgésie morphinique et certaines formes d’analgésie induite par le stress ;

- diminuent la tolérance au lévorphanol ;

- provoque des signes d'abstinence chez des souris rendues dépendantes vis- àvis de cet opioïde ou de la morphine (Kastin et al. 1994).

Cependant, la caractéristique la plus remarquable des peptides de cette famille, qui l’oppose au CCK, au NPFF et à la nociceptine, est de pouvoir interagir directement, comme agonistes partiels, avec les récepteurs µ. Ils peuvent se comporter comme des antagonistes à basses concentrations et, au contraire, comme des agonistes à des concentrations plus élevées. Au total le CCK, le NPFF et la nociceptine n’exercent pas seulement des actions anti-opioïdes, ils présentent aussi

des effets morphinomimétiques (bloqués par la naloxone). Contrairement aux peptides de la famille du MIF, aucun de ces trois peptides n’interagit directement avec les récepteurs des opioïdes. Si le bénéfice que le système opioïde procure à l’individu est facilement concevable, le rôle des peptides anti-opioïdes est, à priori, beaucoup moins clair. On pense qu’il est utile pour l’organisme de déclencher de manière compensatrice une activité anti-opioïde pour rétablir une sensation douloureuse normale. Cette capacité d’augmenter la perception de la douleur s’explique par un processus homéostatique du fonctionnement du système nerveux. Les études pharmacologiques indiquent que les anti-opioïdes se comportent surtout comme des modulateurs des fonctions des opioïdergiques endogènes. En effet, certains anti-opioïdes, tel que le NPFF, sont capables d’induire une analgésie très puissante au niveau spinal. S’il se confirme chez l’Homme, ce mécanisme d’action pourrait permettre d’obtenir une analgésie très efficace, sans générer les effets secondaires liés à l’administration d’opiacés exogènes. Par ailleurs, des avancées thérapeutiques viendront probablement de molécules agissant comme antagonistes des anti-opioïdes.

Les effets de PcTx1 injectée i.c.v. ou i.t. sont similaires à ceux de certains peptides que nous avons décrits précédement, en particulier ceux du NPFF et l’endomorphine-2 injectés dans le liquide céphalorachidien spinal. Ceci est l’argument supplémentaire encourageant l’idée qu’il doit exsiter d’autres petides endogènes capables de moduler l’activité des canaux ASIC et de produire les effets majeurs sur la douleur que nous avons observés en inhibant les canaux ASIC1a par la Psalmotoxine 1.

6 Article

6.1 Introduction

Historiquement, les venins ont permis de mieux comprendre et mieux caractériser les canaux ioniques à la fois dans leurs fonctions cellulaires mais aussi dans leurs fonctions physiologiques. Nous avons étudié in vivo les effets d’un bloqueur spécifique d’ASIC1a, la toxine d’araignée PcTx1. J’ai débuté cette étude en m’intéressant aux effets électrophysiologiques du peptide injecté dans le liquide céphalorachidien de souris au niveau du ventricule latéral. Au départ, cette étude a été lancée car nous pensions que le blocage d’ASIC1a induisait des crises épileptiques : en effet des souris injectées présentent des signes d’hyperexcitabilité, à savoir, un enraidissement de la queue et des vibrations de vibrisses dans les minutes suivant l’injection. Aucun effet n’est observé lors de l’injection dans les tissus périphériques, en condition normale ou inflammatoire, ni lors de l’injection systémique du peptide PcTx1. Lorsque Wemmie et al publièrent la première description phénotypique de souris invalidées pour le gène d’ASIC1a, ils indiquaient que l’absence de ce canal ne semblait pas avoir d’incidence sur la perception nociceptive des souris (Wemmie et al. 2002). Ceci nous a conduit à étudier les effets du blocage spécifique d’ASIC1a dans un modèle de douleur thermique sur des souris sauvages. Nous avons ainsi montré que l’injection de PcTx1 est capable de produire une analgésie chez la Souris lorsqu’elle est injectée dans le liquide céphalorachidien. Cet effet, dose-dépendant, méritait d’être étudié dans d’autres modèles de douleur. En observant les effets sur les souris de la morphine, que nous utilisions comme contrôle positif des effets analgésiques de PcTx1, nous nous sommes rendu compte que ce que nous prenions pour des effets de l’hyperexcitabilité neuronale n’étaient en fait que des effets similaires à ceux que l’on observe chez la Souris injectée avec de la morphine. Ceci a été pleinement confirmé par les enregistrements électroencéphalographiques des souris injectées intracérébroventriculairement avec PcTx1, enregistrements dont l’analyse n’est pas en pas en faveur de crises pharmaco- induites.

récepteurs opioïdergiques. Nous avons confirmé ce point en observant la réversion et l’antagonisation des effets analgésiques de PcTx1 par un antagoniste des récepteurs µ opioïdergiques, la naloxone. Ensuite, nous avons utilisé d’autres antagonistes plus spécifiques des différents récepteurs opioïdergiques afin de caractériser les effecteurs de cet effet analgésique. L’obtention d’un spectre d’activation des récepteurs µ et δ après injection intrathécale de PcTx1 suggère qu’un ou plusieurs peptides opioïdergiques endogènes sont relargués consécutivement à l’injection de PcTx1.

La cible moléculaire de PcTx1 responsable des effets analgésiques aurait pu ne pas être ASIC1a malgré l’abondance des résultats électrophysiologiques déjà obtenus montrant que PcTx1 n’intéragit pas avec les autres membres de la famille des canaux ASIC. D’une part, des études in vitro ont permis d’éliminer un effet de PcTx1 sur les canaux potassiques, sodiques et calciques mais aussi sur les récepteurs opioïdergiques. D’autre part, les effets analgésiques de PcTx1 sont identiques chez les souris injectées avec un oligonucléotide antisens spécifique d’ASIC1a. Ceci démontre bien que les effets que nous avons observés sont bien en rapport avec l’inhibition d’ASIC1a par PcTx1. Cependant, nous sommes toujours dans l’attente des résultats de l’effet de PcTx1 sur les souris invalidées pour le gène ASIC1a.

Comme nous avions mis en évidence une activation des récepteurs opioïdergiques m et d après injection intrathécale de PcTx1, il nous fallait déterminer quel(s) étai(en)t le(s) peptide(s) endogènes responsables. Nous avons obtenu plusieurs souris invalidées pour les précurseurs des peptides opioïdes endogènes. L’absence d’effet analgésique observé chez les souris invalidées pour le gène précurseur des enképhalines révèle que le blocage d’ASIC1a au niveau spinal entraîne une analgésie due au relargage d’enképhalines.

Quelques publications montrent que l’endomorphine-2 injectée dans le liquide céphalorachien spinal ou encore l’injection i.t. d’analogue du NPFF entraîne un relargage de Met-enképhaline ((Ballet et al. 1999; Ohsawa et al. 2001b). Comme le précurseur de l’endomorphine-2 n’est pas connu, il n’existe pas de souris n’exprimant pas ce peptide, mais in vitro, ce peptide n’a pas d’effet sur les canaux ASIC1a tout comme l’endomorphine-1 et les catécholamines (communication personnelle du Dr. Emmanuel Deval). Nous avons donc prélevé le liquide céphalorachidien au niveau d’un ventricule latéral des souris après qu’elles aient été

injectées dans le 3ème _{ventricule avec PcTx1 pour évaluer le relargage d’enképhaline}

induit par PcTx1. Le taux de Leu-enképhaline ne varie pas tandis qu’il y a une élévation très importante (X 4-5) du taux de Met-enképhaline après injection de PcTx1. Nous avons observé la même induction chez des souris traitées avec l’oligonucléotide antisens d’ASIC1a. Le taux de Met-enképhaline n’est pas aussi élevé qu’après injection de PcTx1 mais il faut préciser que le prélèvement de LCR a été réalisé après 3 jours de traitement par oligonucléotide antisens et non après la première journée d’injection.

Nous avons tenté de localiser les sites d’action de PcTx1 aux niveaux spinal et cérébral. Les stratégies mises en œuvre, utilisant la PcTx1 iodée (après adjonction d’un résidu tyrosine permettant la iodation) injectée intracérébroventriculairement et induisant une analgésie, ou encore la biotinilation à PcTx1, se sont révélées inefficaces pour localiser le peptide au niveau de coupes histologiques. De même, l’injection d’antisens marqués par la fluorescéïne n’a pas apporté d’information utile. Nous avons dû nous contenter d’une localisation des ARNm d’ASIC1a révélée par hybridation in situ avec colocalisation immunohistochimique de la Met-enképhaline. Les résultats obtenus mettent en évidence une colocalisation des marquages au niveau des différentes laminae de la corne dorsale. Une localisation plus précise pourrait permettre de déterminer si les canaux ASIC1a et les vésicules contenant la Met-enképhaline sont situées sur les mêmes terminaisons nerveuses ou si les terminaisons neuronales qui contiennent les canaux ASIC1a sont localisées sur un interneurone qui inhiberait le neurone Met-enképhalinergique. Bien entendu, on peut encore spéculer sur d’autres mécanismes.

Les différents modèles de douleur utilisés permettent d’affirmer que l’analgésie provoquée par PcTx1 permet de masquer les douleurs inflammatoires et thermiques aussi efficacement que la morphine. Concernant les douleurs neuropathiques, l’effet de PcTx1 est significatif mais moins important que celui de la morphine. Cela peut suggérer que les mécanismes enképhalinergiques de modulation de la douleur sont déjà activés lors de douleurs neuropathiques , par conséquent, l’effet de l’inhibition d’ASIC1a par PcTx1 sur ce système déjà activé n’est que modéré. Il peut également s’agir d’une diminution de l’expression d’ASIC1a dans ce type de douleur chronique, mais cela reste à vérifier. Pour ce qui est du

modèle d’inflammation que nous avons utilisé, l’injection intraplantaire de formol, il est intéressant de noter que dans la phase purement inflammatoire de ce modèle, l’effet de PcTx1 est supérieur à celui de la morphine. Ceci pourrait être expliqué par le fait que l’expression d’ASIC1a augmente lors de l’inflammation au niveau des neurones homolatéraux de la corne dorsale de la moelle épinière (Wu et al. 2004; Duan et al. 2007). Un autre modèle de douleur inflammatoire, l’injection d’adjuvant de Freund intraplantaire chez le Rat, a été utilisé par Duan et collaborateurs pour montrer que le blocage d’ASIC1a à la fois par l’amiloride et le venin de Psalmopeus

cambredgei qui contient PcTx1 a un effet analgésique. De plus, ces mêmes auteurs

montrent que lors de l’inflammation, l’augmentation de l’expression d’ASIC1a par les neurones de la corne dorsale de la moelle épinière est responsable de l’hypersensibilité induite par l’inflammation. Cette augmentation d’expression d’ASIC1a s’observe dans les mêmes conditions au niveau des neurones du ganglion spinal. De plus au niveau spinal, lors de l’inflammation, le venin de Psalmopeus

cambridgei abolit les décharges toniques et par conséquent inhibe la transmission du

signal nociceptif. Ainsi l’inhibition périphérique d’ASIC1a contribue également à la diminution de la douleur inflammatoire par des mécanismes différents de ceux que nous avons mis évidence.

À l’évidence, la Met-enképhaline induit le même type de tolérance que la morphine en activant les récepteurs µ. Il semble qu’indépendamment de ses effecteurs, l’activation du récepteur µ soit responsable de l’induction d’une tolérance. En effet, la tolérance aux opiacés qui apparaît lors de l’utilisation répétée d’opiacés est due à une désensibilisation des récepteurs µ qui sont des récepteurs couplés aux protéines G. Ce processus de désensibilisation implique une phosphorylation des récepteurs qui permet une liaison à des protéines régulatrices, les β-arrestines, puis une internalisation de ces complexes. Les souris invalidées pour le gène codant la β- arrestine-2 ne présentent plus de tolérance à la morphine (Bohn et al. 2000). L’absence de tolérance à la morphine chez ces souris n’implique pas l’absence de dépendance. Ce qui montre bien que les deux mécanismes sont indépendants l’un de l’autre. La dépendance aux effets de PcTx1 injectée dans le liquide cérébrospinal n’a pas encore été testée et mériterait d’être étudiée.

Enfin, l’induction de troubles moteurs chez la Souris par la morphine est bien établie, il semble que ces effets s’apparentent à une ataxie morphino-induite. Les peptides opioïdes endogènes ne semblent pas induire ce type d’effet indésirable chez les rongeurs (Fichna et al. 2007a).

A tarantula peptide against