OU HCVsp PET)T ET AL V)ROLOGY
En utilisant l anticorps monoclonal anti E E D Petit et collaborateurs ont identifiés puis caractérisés des particules (CV sériques ou (CVsp Petit et al Ces particules virales ont été purifiées à partir de plasmaphérèses de patients atteints d hépatite C chronique Le premier patient (CV L génotype b a développé une hépatite C chronique après une transplantation hépatique Le second patient (CV Fan génotype a a présentait aussi une hépatite C chronique mais associée à une cryoglobulinémie de type )) avec une vascularite cutanée sévère qui nécessite des échanges plasmatiques (enrard et al permettant ainsi de purifier les particules (CV à partir de grands volumes La purification des particules (CV a été réalisée par des étapes successives d ultracentrifugation permettant ainsi de concentrer le matériel viral
L analyse des différentes populations virales par sédimentation sur gradient de saccharose montre la présence de deux sous populations bien distinctes Figure 24 Une première population virale qui sédimente à une densité comprise entre g ml correspondant aux particules associées aux lipoprotéines LVP pour Lipo Viro Particles décrits par André Andre et al Une seconde population virale avec une densité comprise entre g ml correspondant aux virions complets qui expriment les protéines d enveloppe E et E et contiennent l ARN du (CV et l antigène de capside Une analyse en microscopie électronique ME apres immunoprécipitation avec l anticorps anti E E D a permis de visualiser les particules exprimant l épitope D et de determiner la taille des particules Ainsi ces particules ont un diamètre compris entre et nm Par une approche d immunomarquage à l or en ME
nous avons montré que l épitope E E reconnu par
l anticorps D était présent à la surface des (CVsp enveloppés Figure 24: Caractérisation des particules HCV sériques ou HCVsp [Petit et al., 2005]. (A)Distribution des différentes populations virales en fonction de leur densité. (B) expression des protéines d’enveloppe E1 et E2 par western blot avec l’anticorps D32.10. (C) Expression de la protéine de capside par western blot. (D) Analyse des HCVsp par microscopie électronique et détermination de la taille des particules virales. (E) Expression de l’épitope E1E2 à la surface des particules HCV sériques A B C D E
LES CELLULES PROGENITRICES DU FOIE, HepaRG GR)PON ET AL
PNAS PARENT ET AL GASTROENTEROL MA)RE ET AL BBRC
Dans notre laboratoire une lignée originale la lignée (epaRG a été obtenue et caractérisée en collaboration avec l unité )nserm C Guguen Guillouzo Rennes Ces cellules (epaRG ont été isolées à partir d une tumeur d Edmonson de grade résultant d une infection chronique à long terme par le (CV Cette lignée constitue le premier système d étude d un cycle de réplication complet du (BV Gripon et al
L étude réalisée par R Parent dans le cadre de sa thèse au sein de notre équipe a permis de caractériser ces cellules (epaRG aussi bien sur le plan phénotypique que morphologique Parent et al Les résultats ont permis de mettre en évidence le caractère bipotent de ces cellules Sur un plan morphologique l observation en microscopie à contraste de phase à différents stades de culture a permis d identifier une population homogène de type épithélial non différencié au stade prolifératif qui évolue progressivement vers deux types cellulaires morphologiquement distincts l un hépatocytaire ( l autre apparenté aux cellules biliaires B Figure 25 Sur le plan phénotypique le profil d expression des marqueurs de cellules hépatocytaires cytokératine ou CK albumine et (P ou hepatocyte specific antigen de cellules bilaires CK et de cellules souches M PK OV OV et CD a été analysé Tous ces marqueurs sont exprimés dans ces cellules au stade différenncié avec une localisation spécifique selon le type cellulaire Tout au long de la culture les (epaRG acquièrent progressivement un phénotype hépatocytaire polarisée avec l expression de CD la Cadhérine E marqueurs respectifs du pole apical et latéral et ZO un marqueur des jonctions serrées Enfin l expression de CK CK et de marqueurs des cellules ovales M PK et OV dans le tissu hépatique dont sont issues les cellules (epaRG a été analysée Ces expériences ont clairement montré la co expression de tous ces marqueurs dans les zones néoductulaires Cette étude a permis de démontrer que les cellules (epaRG constituent la première lignée de cellules progénitrices hépatiques humaines CK CK M PK et CD positives qui peuvent se différencier en deux types cellules cellules hépatocytaires et biliaires après jours de culture
Plusieurs études ont montré la fonctionalité de ces cellules tant sur le plan métabolique fer cytochrome P Aninat et al Kanebratt and Andersson qu en terme de réponse immunitaire innée Maire et al Dans notre équipe Maire et Parent ont étudié les effets du poly ) C un analogue d ARN bicaténaire sur l expression de l )FN et des chimiokines ainsi que sur la fonctionnalité de la voie de signalisation de l )FN dans les cellules (epaRG Maire et al Ces résultats ont montré que la voie de signalisation induite par l ARN double brin db via le TLR est fonctionnelle dans les cellules (epaRG contrairement aux cellules d hépatome Lanford et al En effet l exposition des cellules (epaRG au poly ) C entraine une induction de l )FN capable d inhiber la réplication du (CV et de certaines chimiokines CXCL )L CXCL ainsi que de leurs récepteurs
Ainsi les cellules (epaRG se révèlent être très intéressantes car elles possèdent des propriétés fonctionnelles voisines des hépatocytes humaines normaux ((N en cultures primaires et permettent de retrouver des conditions in vitro proches de celles rencontrées in vivo
Figure 25: Cinétique morphologique des cellules HepaRG (Parent et al., 2004).
Les cellules ont été observées en microscopie en contraste de phase à différentes phases de culture : (A) début de la phase de prolifération (Jour 2), (B) Phase proliférative avancée (Jour 4 5), (C) Phase intermédiaire ou stationnaire (Jour 7 14), et (D) la phase de différenciation (Jour 28 35). Abréviations H, hépatocytes ; B, cellules biliaires (Grossissement x100).