Les méthodes immunologiques

Les méthodes immunologiques compétitives consistent en un système de dosage dans lequel la 25(OH)D et un traceur marqué entrent en compétition pour la reconnaissance par un anticorps anti 25(OH)D. Les marqueurs peuvent être des isotopes (méthodes radioimmunologiques), des enzymes (méthodes enzymoimmunologiques) ou des molécules phosphorescentes (méthodes luminoimmunologiques)[192].

 Traceur tritié

Les premiers dosages de la 25-OH vitamine D développés avec des anticorps spécifiques faisaient appel au traceur tritié de la 25-OH vitamine D.[192]

 Traceur iodé

Le remplacement du traceur tritié par un traceur iodé d’affinité compatible avec l’anticorps augmente la sensibilité.

L’émission du traceur iodé est facile à détecter par rapport à la radioactivité du tritium qui nécessite l’ajout de liquide scintillant pour sa détection.

Par contre, la demi-vie du traceur iodé (60 jours) est très inférieure à celle du traceur tritié (12 ans), ce qui nécessite de renouveler fréquemment le traceur mais qui facilite la gestion des déchets radioactifs, simplement placés en vieillissement et jetés lorsque le seuil de radioactivité réglementaire est atteint.

Les premiers radioimmunodosages employant un traceur iodé radioactif faisaient appel à une chromatographie préliminaire et ne dosaient que la 25-OH vitamine D3 et non la 25-OH vitamine D2, ce qui limite leur utilité dans le cas de régimes alimentaires suppléés en vitamine D2.

Dans tous cas les techniques radioimmunologiques tendent à disparaître au profit de techniques automatisées enzymoimmunologiques ou luminoimmunologiques.

 Traceur enzymatique

Le principal avantage d’un immunodosage enzymatique sur un radioimmunodosage est l’absence de déchets radioactifs. Le traceur en EIA « enzyme immunoassay » correspond à un dérivé de l’analyte qui est biotinylé. La détection est basée sur la forte affinité de la biotine pour l’avidine ou la streptavidine (4 sites de liaison pour la biotine) couplée à une enzyme. La révélation colorimétrique de la peroxydase ou la phosphatase alcaline

conjuguées à la streptavidine (ou avidine) par le substrat (TMB, OPD) permet un grand débit d’échantillons.

 Immunodosages commerciaux de la 25-hydroxyvitamine D Il n’existe pas de méthode RIA directe de la 25-OH vitamine D. La seule méthode directe est une ELISA commercialisée par IDS ltd mais qui ne reconnaît pas les deux 25-OH vitamines D2 et D3 de la même manière (Tableau IX). Les autres dosages font tous intervenir une étape supplémentaire de précipitation des protéines interférant avec le dosage, en particulier la DBP.

a) Trousses de dosage DiaSorin

 Diasorin RIA :

Cette trousse de dosage requiert une précipitation des protéines de l’échantillon par l’acétonitrile. L’échantillon est alors centrifugé et le surnageant placé en compétition avec un anticorps polyclonal de chèvre spécifique de la les techniques radioimmunologiques tendent à disparaître au profit de techniques automatisées enzymoimmunologiques ou luminoimmunologiques.en présence d’un traceur iodé. La séparation de la fraction de traceur libre de la fraction liée à l’anticorps se fait par immuno-précipitation au moyen d’anticorps de mouton anti-anticorps de chèvre. La détection de la radioactivité se fait sur la fraction décantée après centrifugation. Sa sensibilité est inférieure à 1,1 pmol/mL (2,8 ng/mL) et le dosage effectué dans une gamme de 5 à 150 ng/mL.le spécificité est de 100% pour la 25-OH D2 et pour la 25-OH D3.

 Diasorin liaison CLIA :

Le dosage LIAISON ® 25 OH Vitamin D est un dosage immunologique direct par compétition par chimioluminescence (CLIA) qui permet la détermination quantitative de la 25 OH vitamine D dans le sérum.

 Pendant la première incubation, la 25 OH vitamine D est dissociée de sa protéine de liaison et se lie à l'anticorps spécifique en phase solide. Au bout de 10 minutes, le marqueur (vitamine D liée à un dérivé de l'isoluminol) est ajouté.

 Après une deuxième incubation de 10 minutes, la matière non liée est éliminée par un cycle de lavage. Les inducteurs sont ensuite ajoutés et une réaction instantanée de chimioluminescence est amorcée. Le signal lumineux est mesuré en unités de lumière relative (RLU) par un tube photomultiplicateur et il est inversement proportionnel à la concentration de 25 OH vitamine D dans les étalons, les contrôles ou les échantillons .La spécificité est de 104% Pour la 25-OH D2 et 100% pour la 25-25-OH D3.

b) Trousses de dosage IDS

 IDS-RIA :

Cette trousse de dosage requiert une précipitation des protéines de l’échantillon par l’acétonitrile. L’échantillon est alors centrifugé et le surnageant placé en compétition avec un anticorps polyclonal de mouton spécifique avec un traceur iodé. La séparation de la fraction de traceur libre de la fraction liée à l’anticorps se fait au moyen d’anticorps anti-anticorps de mouton fixés sur cellulose. La détection de la radioactivité se fait sur la fraction décantée après

centrifugation. La sensibilité est inférieure à 3 pmol/mL (1,2 ng/mL). Une autre trousse est commercialisée sous licence IDS par Nichols Institute Diagnostics .

 IDS-EIA :

La trousse de dosage direct en ELISA de IDS fonctionne en format 96 puits. L’ajout d’un tampon dissociant permet de s’affranchir des interférences dues à la DBP. Sa sensibilité est inférieure à 6 pmol/mL (2,4 ng/mL) et sa gamme d’utilisation de 6 à 360 pmol/mL (2,4 à 144 ng/mL). C’est la seule trousse de dosage de la 25-OH vitamine D qui procède sans extraction ni précipitation. Les dosages directs sont plus rapides que les autres méthodes de par l’absence de toute étape supplémentaire de précipitation, d’extraction ou de prépurification. Le dérivé biotinylé de la vitamine D nécessaire à un tel dosage n’est pas décrit.

c) Trousses de dosage IBL (Immuno-Biological Laboratories)

Cette trousse dose la 25-OH vitamine D3 uniquement. Les échantillons sont extraits par l’acétonitrile de la même façon que les autres trousses. L’originalité vient du fait que c’est la seule trousse dans laquelle l’anticorps est immobilisé sur des tubes plastiques (tubes « coatés »). Il n’y a plus d’étape supplémentaire d’immunoprécipitation comme dans les deux trousses précédentes. Cette trousse utilise aussi un traceur iodé radioactif et la séparation de la fraction libre de la fraction liée à l’anticorps s’effectue par simple aspiration du milieu d’incubation.

d) Trousses de dosage Abbott

ARCHITECT 25-OH Vitamin D est un dosage immunologique en une étape retardée, avec pré-traitement de l'échantillon, pour la détermination quantitative de la vitamine D dans le sérum et le plasma humains. Il utilise la technique immunologique microparticulaire par chimiluminescence (CMIA), avec des protocoles de dosage flexibles, appelée Chemiflex. L'échantillon et le réactif de pré-traitement sont mis en présence. Le diluant de dosage et les microparticules paramagnétiques recouvertes d'anticorps anti-vitamine D sont ajoutés a une partie aliquote de l'échantillon prétraité pour créer le mélange réactionnel. La vitamine D présente dans l'échantillon se lie aux microparticules recouvertes d'anticorps anti vitamine D. Aprés incubation, le conjugué sous forme d'un complexe d'IgG anti-biotine / vitamine D biotinylée marqué a l'acridinium est ajouté au mélange réactionnel et se lie aux sites de liaison libres sur les microparticules recouvertes d'anticorps anti-vitamine D.

Aprés lavage, les solutions de pré activation et d'activation sont ajoutées au mélange réactionnel. La réaction chimiluminescence qui en résulte est mesurée en unités relatives de lumière (URL). Il existe une relation indirecte entre la quantité de vitamine D présente dans l'échantillon et les URL détectées par le système optique ARCHITECT i System [193].

e) Trousses de dosage Roche

Test par électrochimiluminescence (ECLIA) pour la détermination in vitro de la teneur totale en 25-hydroxyvitamine D, le test Elecsys® Vitamin D total utilise la protéine VDBP pour la détection de la 25-hydroxyvitamine D3 et D2. Le test est utilisé pour la détermination quantitative des taux de vitamine D

(25-OH) dans le sérum et le plasma humains dans le cadre de l’évaluation d’un manque de vitamine D( figure 23).

-Dans un premier temps, l’échantillon est incubé 9 minutes avec un réactif de prétraitement. À ce stade, la VDBP naturelle de l’échantillon est dénaturée pour libérer la vitamine D (25-OH) liée.

-Dans un deuxième temps, l’échantillon est incubé avec de la VDBP recombinante marquée au ruthénium, ce qui conduit à la formation de complexes de vitamine D (25-OH) avec la VDBP ruthénylée.

- Dans une troisième étape, l’ajout de vitamine D (25-OH) biotinylée permet d’occuper les sites de liaison encore libres de la VDBP. Les complexes ainsi obtenus de VDBP marquée au ruthénium et de vitamine D (25-OH) biotinylée se lient à la phase solide (interaction entre la biotine et les microparticules couvertes de streptavidine qui sont fixées à la surface de l’électrode). Les substances non liées sont éliminées. L’application d’une tension éléctrique à l’éléctrode lance la réaction de chimiluminescence, laquelle est mesurée au moyen d’un photomultiplicateur. Les résultats sont déterminés à l’aide d’une courbe de calibrage spécifique à l’appareil, calculée à partir d’un calibrage de 2 points et d’une courbe maîtresse grâce au code-barres du réactif

Figure 23 : Principe de compétition mettant en jeu la protéine porteuse de la vitamine D

(VDBP)