Les facteurs induisant l’expression de CD146 138

Comme mentionné auparavant, des études ont montré qu’il est aussi possible d’induire l’expression de CD146 dans les cellules par des signaux environnementaux tels que des cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, l’IL-1a [223, 224], l’IL-13 [225]), des facteurs de croissance (l'endothéline-1 [226], le TFG-β [227], le NGF [228]), un taux élevé de glucose [229], une concentration élevée de Ca2+ [230] et une augmentation de AMPc [231]. Certains de ces facteurs sont retrouvés dans le microenvironnement tumoral. Cet environnement est très complexe et formé de nombreuses cellules qui interagissent les unes avec les autres via la sécrétion de différents facteurs comme des cytokines ou des facteurs de croissance. Quoique techniquement complexe, il serait intéressant de séparer chaque constituant d’une tumeur et de les co-cultiver avec des PBMC autologues afin d’identifier les cellules responsables de l’induction de l’expression de CD146 et de caractériser les mécanismes mis en jeu dans ce processus.

Nos observations ont permis de soulever des pistes qui devront être approfondies, mais qui ont permis d’identifier des facteurs responsables de l’induction de CD146 dans les cellules immunes :

Lors d’essais in vitro, nous avons confirmé que l’activation des lymphocytes par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 induit l’expression de CD146 (Figure 16) [232]. Nous avons aussi observé que cette induction pouvait être réalisée en présence de cellules de lignées

tumorales dans les lymphocytes T CD4 ou CD8 (Figures 16 et 21). Ce qui suggère que CD146 se comporte comme un marqueur d’activation.

Intéressament, la co-culture in vitro de PBMC non-activées avec des cellules cancéreuses, résulte en l’induction de CD146 dans les lymphocytes (Figures 21), particulièrement lorsque les cellules tumorales expriment CD146, ce qui suggère un possible rôle des interactions homotypiques dans l’augmentation de l’expression de CD146. Afin de vérifier ce point, il serait intéressant de réaliser des co-cultures de PBMC avec des lignées de cellules tumorales dont l’expression de CD146 serait bloquée par un anticorps [204, 254] ou par l’utilisation ARN interférant.

Après avoir mis en évidence l’implication des cellules tumorales dans l’expression de CD146, on s’est demandé si cette induction pouvait varier en fonction de l’état physiologique des cellules tumorales. En effet, les tumeurs solides sont caractérisées par leur vascularisation très hétérogène. Elles contiennent donc de larges régions souffrant d’un manque d’oxygène (hypoxie) dans lesquelles les cellules sont en souffrance. Ces zones ont été largement mises en évidence dans la plupart des grosses tumeurs (> 10 mm) [285] et une étude a même montré que les petites tumeurs (< 1 mm) sont également pauvrement vascularisées et présentent de l’hypoxie [286]. L’environnement pauvre en nutriments carbonés et en oxygène exerce ainsi une pression sur les cellules tumorales aboutissant à leur mort et à la formation de zones de nécrose dans les tumeurs.

Il a été très intéressant de mettre en évidence un lien entre l’expression de CD146 dans les TIL CD4+ _{déterminée par CF et la présence de nécrose dans les tumeurs de CCRCC décrite}

dans les rapports de pathologie (Figure 17 A). Des études plus poussées sur des coupes de tissus pourraient être réalisées à l’avenir afin de localiser les cellules exprimant CD146 et les zones de nécroses dans les tumeurs afin de vérifier le lien entre ces deux paramètres.

Nous avons évalué in vitro l’implication de l’hypoxie et des dommages qu’elle peut causer sur les cellules (nécrose) dans l’induction de l’expression de CD146 dans les cellules immunes.

(Hg)) à des lymphocytes cultivés en hypoxie (environ 1,5 % O2 soit 10 mm Hg) (Figure 26).

Nous n’avons observé aucune différence d’expression de CD146 dans les lymphocytes cultivés dans ces deux conditions. Afin de valider le statut hypoxique dans lequel nos cellules ont été cultivées, nous souhaitons mesurer l’expression du facteur induit par l’hypoxie (HIF) dans les lymphocytes. En moyenne, la pression en O2 dans la fraction hypoxique globale des

tumeurs du sein est de 10 mm de Hg. Il a été montré que dans d’autres types de tumeurs, la pression en O2 pouvait descendre à moins de 2 mm de Hg, ce qui correspond à un niveau

d’oxygène atmosphérique inférieur à 0,2 % [287]. Il serait donc intéressant de confirmer nos résultats avec des cultures à des niveaux plus faibles d’O2.

Figure 26 : Impact de la déplétion en O2 sur l’expression de CD146 dans les

lymphocytes.

Des PBMC de donneurs normaux (n=3) ont été cultivées dans des conditions d’activation (anti-CD3, anti-CD28 et IL-2) pendant 4 jours en normoxie (20 % O2 distribué par un incubateur de base) ou en hypoxie (environ 1,5 % O2). L’expression de CD146 a été

évaluée par CF dans les lymphocytes T CD3+ CD4+ (A) et dans les CD3+ CD8+(B).

Ensuite, nous avons testé in vitro l’impact des cellules tumorales en nécrose. Pour ce faire, nous avons co-cultivés des PBMC avec des cellules de lignée de cancer du rein les KTCL-140 et les A-498 dont la mort avait été induite par différents chocs thermiques. Le statut de mort des cellules étant confirmé par un marquage Annexine V/7-AAD (Figure 22). Pour les KTCL-140, lors de la co-culture de PBMC avec des cellules tumorales dont la mort avait été provoquée par des chocs thermiques dits « à froid » (5 cycles de 5 minutes cycles à -

CD3+ _CD4+ _cells 0 1 2 3 4 0 10 20 30 40 50 C D 14 6 (% ) 20 % O2 1,5 % O₂ Culture days CD3+ _CD8+ _cells 0 1 2 3 4 0 10 20 30 40 50 C D 14 6 (% ) 20 % O2 1,5 % O₂ Culture days A B

80°C puis +37°C) on observe une plus forte expression de CD146 dans les lymphocytes T que lors de la coculture avec des cellules tumorales traitées par chocs thermiques dits « à chaud » (5 cycles de 5 minutes cycles à +60°C puis +4°C) ou que la co-culture de cellules tumorales non traitées (Figure 17 B à G). Nous avons remarqué que ces deux types de traitement induisent différentes nécroses, ainsi un traitement des cellules par un choc thermique « à froid » induit une destruction complète des cellules alors qu’un traitement à « à chaud » induit la mort des cellules, mais permet de conserver leur intégrité (Figure 22), ceci permet de supposer que les facteurs responsables de l’induction de CD146 se trouvent dans la cellule tumorale. Les résultats obtenus avec les KTCL-140 n’ont pas été répétés avec les A-498 (Figure 23) dont la mort a été induite de la même façon. Nous proposons de réaliser ces expériences avec d’autres lignées de cancer du rein exprimant CD146 et de réaliser une étude protéomique sur le contenu de KTCL-140 traitées des deux façons afin d’identifier le ou les facteurs induisant CD146 dans les cellules.

Nous sommes conscient que ces conditions de mort cellulaire ne sont pas physiologiques et ne seront pas retrouvées dans les tumeurs toutefois, la nécrose par choc thermique se rapproche probablement de la nécrose intra-tumorale (production de damage- associated molecular patterns ). Il serait intéressant de voir si nos résultats peuvent être répétés avec des cellules tumorales dont la mort pourrait être induite par hypoxie prolongée à des niveaux d’O2 se rapprochant de ce que l’on retrouve des les tumeurs réellement hypoxique

comme le cancer du rein par exemple.

Nos résultats ont permis de montrer que l’induction de CD146 par les cellules tumorales et les cellules necrotiques nécessite un contact direct avec les PBMC (Figure 17 et

27). En effet lorsque les PBMC sont séparées des cellules tumorales par une membrane

poreuse ou qu’elles sont cultivées en présence de milieu conditionné par les cellules tumorales, les PBMC conservent une expression en CD146 constante, alors que les cellules cultivées en contact direct avec les cellules tumorales montrent une augmentation de leur expression. Ceci nous laisse penser que les cellules tumorales vont participer à l’induction sélective de l’expression de CD146 dans les TIIC.

Figure 27 : L’expression de CD146 induite dans les cellules immunes lors du contact avec les cellules tumorales.

1X106 PBMC de donneurs sains (n=3) ont été cultivées dans des conditions d’activation (anti-CD3, anti-CD28, IL-2 voir section Matériel et Méthodes du Manuscrit II) dans une plaque 24 puits pendant 3 jours (ø) avec 5X105 KTCL-140 (KTCL) ou des KTCL- 140 dont la nécrose a été induite par un choc thermique dit « à froid » : KTCL « cold » (5 cycles de 5 min de -80°C à +37°C) ou à chaud : KTCL « hot » (5 cycles de 5 min de +60°C à +4°C); ou bien avec des milieux conditionnés (CM) obtenus par centrifugation après traitement de ces cellules. Dans une troisième condition, les PBMC et les cellules tumorales ont été physiquement séparées lors de leur culture en chambre de Boyden avec une membrane composée de pore de 3 µm. Les PBMC ont été cultivées dans l’insert et les cellules tumorales dans la plaque.

L’expression de CD146 a été évaluée en cytométrie en flux dans les lymphocytes CD3+CD4+ (A) et les CD3+CD8+ (B). Chaque expérience a été réalisée en duplicata. Ici représenté la moyenne ± SEM.

Enfin, nos études in vitro ont montré que le niveau d’expression de CD146 induit par contact avec des cellules tumorales ou par des cellules tumorales nécrotiques était le même dans les lymphocytes T CD4 et dans les CD8 alors que in vivo, nos résultats ont montré que l’expression de CD146 n’est pas présente dans toutes les populations de TIIC (Figure 15). Nous supposons que cette observation est causée par une activation spécifique facilitée in vitro l’activation de récepteurs présents à la surface de certaines populations de cellules immunes.