Le modèle 3D multicellulaire de sphéroïdes

4.1.1. Caractéristiques du modèle MCS et mécanisme de formation

Les sphéroïdes multicellulaires sont le modèle 3D le plus utilisé dans la recherche sur le cancer. Cette popularité est due à son intégration de plusieurs caractéristiques retrouvées dans les tumeurs dont : l’hétérogénéité cellulaire, la géométrie en sphère qui définit les MCSs homotypiques et leur reproduction des différentes conditions retrouvées in vivo, telle que l’hypoxie, la nécrose, l’angiogenèse, l’invasion et les métastases.103, 106, 108,111

Le mécanisme de formation du modèle multicellulaire sphéroïde MCS, commence par une agrégation qui est le résultat de l’interaction entre l’intégrine à la surface des cellules et la matrice extra cellulaire MEC. Cette interaction résulte en une formation d’agrégats qui permet l’interaction cellule-cellule et qui induit en conséquence une régulation à la hausse des protéines transmembranaires appelées cadhérines. Ces interactions protéiques vont permettre une forte compaction qui est due à l’interaction homophilique des cadhérines pour former le MCS (Figure 8). 112–116_{Certains modèles} cellulaires ne parviennent pas à accomplir l’étape de compaction et forment plutôt des agrégats 3D. En effet, les niveaux et le type de ces protéines impliquées dans la formation des modèles MCS 3D diffèrent d’un type cellulaire à un autre. 103

Les MCSs varient de 20µm à plus de 1mm de diamètre et sont constitués d’une structure à trois couches de cellules asynchrones : des cellules prolifératives, des cellules quiescentes et des cellules nécrotiques. Ces trois états cellulaires sont le résultat de la diffusion par gradient des nutriments, de l’oxygène et des déchets (Figure 9).117, 118 _{En fait, l’exposition des cellules en surface aux nutriments}

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et à l’oxygène favorise la prolifération, alors que l’exposition restrictive des cellules de la couche quiescentes à ces derniers réduit leur activité métabolique ce qui enclenche un état de quiescence. Pour finir la formation de la couche cellulaire nécrotique est due à la privation de nutriments et d’oxygène ainsi qu’à l’accumulation de déchets.119,120

Figure 8 : Processus de formation d’un sphéroïde multicellulaire.

Tirée de Benien et al.

(2014).

(A) Formation d'agrégats de cellules médiée par la liaison intégrine – ECM; (B) Le passage à une étape de transition nécessaire pour l’accumulation de l’E-cadhérine. (C) Quand cette dernière atteint un certain niveau, des interactions homophiliques entre cadhérine – cadhérine se forment et permettre la compaction du sphéroïde. ECM : matrice extracellulaire MEC.

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Figure 9 : La diffusion par gradient dans les sphéroïdes. Tirée de Hirschhaeuser et al. (2010).118 Regroupement de plusieurs images analytiques réalisée par Hirschhaeuser et al. à partir de coupes de sphéroïdes utilisant plusieurs technologies118 _{: autoradiographie, dosage en tunnel, imagerie de} bioluminescence et sonde avec des microélectrodes à oxygène. Reflétant l’arrangement concentrique de la prolifération cellulaire, les différents micromilieux et la viabilité des cellules dans les sphéroïdes.

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4.1.2. Utilisation des MCS hétérotypiques dans la compréhension du processus cancéreux

L’utilisation des MCSs comme modèle pour la recherche sur le cancer confère une certaine flexibilité dans l’intégration de différentes caractéristiques tumorales. L’utilisation des MCSs hétérotypiques qui sont produits en co-cultivant des cellules cancéreuses avec des fibroblastes et des cellules endothéliales en est un bon exemple. Ce type de MCS a beaucoup participé dans la compréhension des processus tumoraux qu’on ne parvenait pas investiguer dans les modèles 2D.102 _{Par exemple, la} reproduction de la structure de l’épithélium mammaire en utilisant des cellules endothéliales pour former des MCSs polarisés avec une lumière a permis d’étudier la morphogenèse de l’épithélium mammaire et la compréhension des voies oncogéniques impliquées dans la survie des cellules.121,122 Un autre exemple est l’utilisation des MCSs pour la création de modèles 3D hétérotypiques qui représentent l’architecture des tissus invivo. Ceci est achevé en co-cultivant différents types cellulaires, telle que la co-cultivation de cellules endothéliales pour mimer la vascularisation dans les tumeurs invasives et qui permet la diffusion des nutriments et de l’oxygène dans ce type de tumeurs.123 _{Un dernier exemple serait la contribution des MCSs dans l’étude du comportement des} cellules immunitaires en co-cultivant des cellules tumorales avec des macrophages et des lymphocytes NKT, ce qui a permis d’explorer leur potentiel cytotoxique ainsi que d’autres caractéristiques immunitaires invasives des tumeurs.124

4.1.3. Techniques de culture des sphéroïdes

Il existe différentes méthodes utilisées pour cultiver des MCSs in vitro. Certaines se basent sur le type de support non-adhésif ou l’utilisation de billes, et d’autres sur l’application de forces rotationnelles ou gravitationnelles (Figure 10).125 _{Un résumé de chaque technique est présenté ci-} dessous.

• Technique de la gouttelette suspendue

Cette technique consiste à cultiver des cellules en suspension dans des gouttelettes déposées dans des puits sur des plaques appropriés, ou juste sur le couvercle d’une boite à pétri en verre qui est inversée comme démontré sur la Figure 10. L’avantage de cette technique et qu’elle ne nécessite pas la production de support ou d’enrobage des plaques, ainsi que sa rapidité. Cependant elle ne serait pas adéquate pour des expériences à grande échelle.126

28 • Techniques de culture sur supports synthétiques

Ces techniques se basent sur la production de supports qui miment les matrices extracellulaires et favorisent la formation du sphéroïde. Plusieurs matériaux sont utilisés dans ces supports, tel que les matrices faites en polymères de polyester ou de collagène. Cette technique est compatible avec les études à grande échelle et permet de générer des sphéroïdes de taille uniforme et de les cultiver pendant une longue période. La limite la plus contraignante de cette technique est la difficulté de récupération des sphéroïdes pour des analyses supplémentaires.127

• Culture sur support non adhésive

Les supports non-adhésifs peuvent être de l’agar, de l’agarose du matrigel ou d’autres matériaux qui permettent de maintenir les cellules en suspension et facilitent leur agrégation. Cette technique rapide présente de nombreux avantages, comme son application aux expériences à grande échelle, permet aussi la formation de sphéroïdes en co-cultivant différents types cellulaires, ainsi qu’une analyse qui ne nécessite pas une collecte des sphéroïdes et qui peut se faire sur le même support. L’importante limite de cette technique est la variation dans la taille et de la forme des sphéroïdes produits.128

• Culture dans des flacons spinner, tubes ou erlenmeyers avec agitation

Cette méthode se base sur la culture de cellules dans une vaisselle de laboratoire qui permet une rotation à grande vitesse du milieu de culture induisant l’agrégation des cellules en sphéroïdes. Cette rotation à grande vitesse permet la diffusion uniforme des nutriments et de l’oxygène, comme celle retrouvée in vivo et permet de produire des sphéroïdes à grande échelle qui sont de taille uniforme. Cependant, cette technique ne convient pas à tous les types cellulaires dû au stress rotatif qui est assez important et qui peut détruire les agrégations à faibles forces intra-cellulaires.103,129

La culture dans des bioréacteurs NASA dont le principe est le même que celui expliqué plus haut, utilise un autre type de contenant. 130

• Billes de transport

Des billes de dextran couvertes de diethylaminiethyl (DEAE), collagène ou autres, sont utilisées comme support et permettent l’agrégation de cellules qui forment plusieurs monocouches mais ne permet pas de former des sphéroïdes réguliers. Cette méthode est souvent utilisée pour les MCSs hétérotypiques qui forment seulement des agrégats.131

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Toutes ces techniques présentent des avantages et des limites, le choix de la technique à utiliser doit être fait selon le but de la recherche et l’analyse désirée.

Figure 10 : Techniques de culture in vitro des sphéroïdes. Tirée de Benien et al. (2014).116

(A) Technique de la gouttelette suspendue ; (B) Auto-assemblage sur les plaques Primaria; (C) Culture cellulaire sur une surface non adhésive; (D) Technique de micromoulage; (E) Culture cellulaire à base de PNIPAAm; (F) bioréacteur de la NASA; (G) culture en rotation; (H) Cultutre sur échafaudage; (I) Culture de sphéroïdes par ajout de substances pour stimuler leur croissance. PNIPAAm: Poly (Nisopropylacrylamide). (Voir texte pour plus d’information). Illustration par