Développement d’un modèle 3D de sphéroïdes déficient en RH pour le criblage des PARP

D. Les sphéroïdes dans l’étude du profil d’une drogue

3. Développement d’un modèle 3D de sphéroïdes déficient en RH pour le criblage des PARP

Mon projet vise aussi à développer des modèles 3D qui représenteraient une plateforme pour les essais de létalité synthétique. Le but étant de reproduire la déficience en recombinaison homologue dans un modèle sphéroïde 3D et tester l’efficacité des réactions de létalité synthétique étudiées. Ces modèles développés permettraient de se rapprocher du contexte tumoral et ainsi établir des traitements efficaces qui pourraient être traduits en clinique.

Matériels et méthodes

1. Étude fonctionnelle du domaine N-terminal de liaison à l’ADN de PALB2

- Constructions plasmidiques

Les plasmides YFP-CTL, YFP-PALB2, FLAG-CTL et FLAG-PALB2 étaient des plasmides disponibles au laboratoire utilisés dans d’autres études 46_{. Les deux plasmides contenant le gène}

PALB2 ont été modifiés par mutagénèse en utilisant les amorces JYM3892/3893, pour être résistants

au siARN dirigé contre ce dernier (tableau 2).46_{Les deux plasmides FLAG/YFP-PALB2-146AAAA} mutants ont été obtenus par mutagenèse dirigée sur les deux plasmides sauvages en utilisant le kit Q5 de NEB et les amorces JYM3909/JYM3910 détaillées dans le tableau 2. Le mutant 146AAAA est le résultat de la mutation de quatre acide aminés RRKK, deux Arginine en position 146 et 147, ainsi que deux Lysine en position 148 et 149.

- Lyse cellulaire et extraction des protéines

Le culot de cellules est resuspendu dans 80-100 µl de tampon IP500 (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,5% NP-40), 4 à 5 fois le volume du culot supplémenté avec les inhibiteurs de protéases (1 mM PMSF, 0,019 UIT/mL aprotinine et 1µg/mL de leupeptine) ainsi que des inhibiteurs de phosphatases (5 mM NaF et 1 mM Na3VO4) et incubé pendant 10 minutes sur glace. Les cellules sont ensuite soniquées dans un Bioruptor pendant 5 minutes (cycle 30 sec ON/OFF) et centrifugées pendant 10 minutes à 4°C vitesse maximale pour clarifier l’extrait. Le surnageant est ensuite récupéré et les extraits sont dosés par la méthode Bradford (Bio-Rad). Les protéines sont resuspendues dans du tampon de dépôt sur gel (loading buffer (2X)) et conservées à -20°C jusqu’à utilisation.

- SDS-PAGE et Western blot

Les protéines extraites sont déposées sur gel SDS-PAGE puis transférées sur une membrane de nitrocellulose par la technique de Western blot. Celle-ci est ensuite bloquée dans du PBS-Tween 0,05% contenant 5% de lait pendant 1 heure, suivie d’une incubation de 16 heures dans l’anticorps PALB2 (développé au laboratoire) dilué à 1 : 4000 dans du PBS-Tween 0,05% contenant 5% de lait. 3 lavages de 7 minutes au PBS-Tween 0,05% sont effectués avant de mettre la membrane dans l’anticorps secondaire de lapin dilué dans le même tampon que l’anticorps primaire à 1 :1000. Une dernière incubation de 45 minutes dans l’anticorps secondaire est effectuée suivie de 3 lavages au

PBS-Tween 0,05%. Les protéines sont par la suite révélées par chimiluminescence à l’aide du kit Amershal ECL PlusTM_.

- Essai CRISPR-Cas9 mClover-LMNA1

Les cellules U2OS ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits et incubées six à huit heures avant la transfection des siARN en utilisant la Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).29_Vingt-quatre heures plus tard 1,5 à 2 millions de cellules ont été récoltées pour les quatre conditions et resuspendues dans un mix de 100 µl de solution de nucléofection (lignée cellulaire 4D-Nucleofector X Kit SE, SE) ou l’on a ajouté 1 µg du plasmide pX330-LMNAgRNA contenant la Cas9 et le guide ARN qui cible la lamine du noyau. 1 µg de notre plasmide donneur mClover pCR2.1-mClover- LMNAdonor contenant les séquences d’homologies de la lamine pour lui conférer la couleur verte, ainsi que 0,1 µg du plasmide iRFP670 qui était utilisé comme contrôle de transfection ont été ajoutés au mix.46,175_{Un vecteur vide pcDNA3 a été ajouté pour les mixs des deux conditions siCTL+FLAG} et siPALB2+FLAG, alors que les plasmides FLAG-PALB2 sauvage ou FLAG-PALB2-146AAAA mutant ont été ajoutés aux deux conditions siPALB2 restantes. Avant de transférer les mix dans des cuvettes certifiées Lonza pour nucléofection, une dose de 20nM de chaque siARN a aussi été ajoutée pour chaque condition. Les cuvettes sont ensuite placées dans le nucléofecteur 4D-Nucleofector X et les cellules nucléofectées en utilisant le programme CM-104. Tout de suite après la nucléofection environs 500 µl de chaque condition est pipeté de la cuvette, à l’aide d’une pipette pasteur jetable, et transféré dans des boites pétri de 10 cm contenant le milieu approprié. Les cellules sont laissées en culture pendant 48 heures puis sont récoltées par trypsinisation et étalées sur des lamelles en verre à une concentration de 500 000-750 000 cellules par lamelle. En parallèle, 1 million de cellules est aussi récolté puis lavé au PBS 1X et conservé à (-80 °C) pour l’extraction des protéines et le western blot. Les cellules ensemencées sur les lamelles en verre sont incubées pendant au moins six heures avant fixation. Après 6 heures le milieu est aspiré et les lamelles sont lavées au PBS 1X une fois et incubées pendant 10 minutes dans du paraformaldéhyde à 4% (Cedarlane Labs) dilué dans du PBS 1X. Les lamelles sont ensuite lavées une fois au PBS 1X et incubées pendant 20 minutes dans du DAPI 4, 6-diami-dino-2-phenylindole (1 µg /mL) dilué à 1 :1000 dans du PBS 1X. Pour finir les lamelles sont lavées une fois au PBS 1X et montées sur des lames pour la microscopie en utilisant du pPDA (90% de glycérol contenant 1 mg/mL Para Phényle Diamine anti-décoloration).

Les lames sont visualisées en microscopie à fluorescence au grossissement (63X, Leica Microscope DM6000). Pour l’évaluation des niveaux de fluorescence mClover environs 20 champs par condition ont été analysés pour un total de 100 cellules/condition. Les données sont représentées sous forme de nuage de points dans le graphique sont le pourcentage moyen de cellules positives pour la

fluorescence mClover par rapport au nombre de cellules iRFP positives tiré de cinq expériences indépendantes. Standard Error of the mean (SEM) ainsi qu’une One-way Anova ont été effectués pour la représentation graphique des résultats.

Figure 11 : Schéma explicatif de la démarche à suivre pour le test CRISPR-Cas9 mCloverLMNA1 dans les cellules U2OS. Le mutant dans la figure correspond au mutant

39 - Foyers RAD51 en immunofluorescence

Les cellules HeLa ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits sur des lamelles et incubées pendant 18 heures avant transfection des siARN (siCTL, siPALB2) à une concentration de 50 nM en utilisant la Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Après 5 heures, un double blocage à la thymidine est effectué en ajoutant 2 mM de thymidine et les cellules sont incubées pendant 18 heures puis relâchées pendant 9 heures en changeant le milieu pour que les cellules continuent leur progression dans le cycle cellulaire. Au moment de la relâche avant l’incubation de 9 heures les cellules sont complémentées par les constructions plasmidiques correspondantes soit : le vecteur vide, YFP- PALB2 sauvage ou le YFP-PALB2 mutant selon la condition, en utilisant la Lipofectamine 2000. Les cellules sont, à partir de cette étape, protégées de la lumière. Après 9 heures les cellules sont traitées une deuxième fois à la thymidine et incubées pendant 17 heures puis relâchées pour 2 heures pour être par la suite irradiées aux rayons gamma à une dose de 2 Gy et enfin incubées pendant 4 heures avant le test d’immunofluorescence.

Après 4 heures les cellules sont fixées dans 4% de paraformaldéhyde dilué dans du PBS 1X pendant 10 minutes suivie par 3 lavages au PBS 1X avant l’ajout de 100% de méthanol à -20°C et incubées à cette température pendant 5min. Toutes les dilutions et les lavages sont fait dans du PBS 1X. Les cellules sont ensuite perméabilisées en ajoutant du Triton X-100 à 0,2% pendant 5 minutes suivie par une incubation de 5 minutes dans 0,1% de sodium borohydride pour diminuer l’intensité de la fluorescence. Les cellules sont alors bloquées dans une solution qui contient 10% de sérum de chèvre et 1% de BSA (Albumine de sérum bovin) pendant 1 heure, puis lavées au PBS 1X et incubées avec les anticorps primaires RAD51 (B-bridge International, # 70–001) et Cycline A (BD Biosciences, # 611268) dilués dans 1% de BSA. Des lavages au PBS 1X sont effectués avant d’ajouter les anticorps secondaires Alexa Fluor 568 anti-chèvre de lapin (Invitrogen, n ° A-11011) et Alexa Fluor 647 antisouris de chèvre (Invitrogen, n ° A-21235) qui sont dilués dans la même solution que les anticorps primaires. Après une heure d’incubation avec les anticorps secondaires un lavage est effectué suivi par une incubation de 10 minutes avec du DAPI à 1mg/mL. Pour finir les lamelles sont lavées une fois et montées sur des lames pour la microscopie en utilisant du pPDA (90% de glycérol contenant 1 mg/mL Para Phényle Diamine anti-décoloration).

Les images représentées ont été acquises à un grossissement de 63X et un empilement en Z (Z

stacking) sur un Microscope DM6000 Leica, puis déconvoluées et analysées pour la formation de

foyers RAD51 avec le logiciel Volocity v6.0.1 (Perkin-Elmer Improvisation). Le nombre de foyers RAD51 par cellules positives à la cycline A (n = 300), parmi la population transfectée marquée à la

YFP, a été quantifié manuellement et représenté en nuage de points sur le graphique représentant la SEM. Un test Anova (test de Kruskal-Wallis pour des comparaisons multiples) suivi d'un test non paramétrique de Mann-Whitney ont été réalisé.

Figure 12 : Schéma des étapes suivies pour l’essai de la quantification des foyers RAD51 dans les cellules HeLa siPALB2 complémentées avec le PALB2 sauvage ou mutant (146AAAA).

Illustration par Nadine Brahiti.

2. Identification de nouveaux interacteurs de PALB2 par la technique BioID

- Système Flp-In™ T-REx™ 293

La lignée cellulaire Flp-In™ T-REx™ 293 est conçue pour la génération rapide de lignées cellulaires stables qui assurent une expression homogène et inductible à la tétracycline de la protéine d'intérêt. Elles contiennent deux vecteurs plasmidiques le pFRT/lacZeo et le pcDNA™6/TR intégrés de manière stable. Le premier, pFRT/lacZeo confère la sensibilité à la zéocin après l’intégration du gène d’intérêt dans son site FRT Flp Recombination Target, qui est ciblé par la recombinase Flp et se trouvant juste après le codon d’initiation du lacZ-Zeocin (Figure 13). Le deuxième vecteur, pcDNA™6/TR, exprime constitutivement le répresseur de la tétracycline, qui permet de réguler l’activité du promoteur TetO2.

La co-transfection des lignées cellulaires Flp-In ™ avec un vecteur d'expression Flp-In ™ (pcDNA5 / FRT / TO) et le vecteur contenant la recombinase Flp, pOG44, résulte en une intégration ciblée du

vecteur d'expression au même locus dans chaque cellule (Figure 13). La recombinaison homologue se fait entre les sites FRT dans pcDNA5 / FRT / TO et le chromosome de la cellule hôte, catalysée par la recombinase Flp exprimée à partir du vecteur pOG44. Ces cellules peuvent être par la suite sélectionnées avec l'hygromycine et la blasticidin, une résistance acquise à la suite de l'événement de recombinaison et l’intégration du gène d’intérêt par la recombinase Flp.

Figure 13 : Schéma représentatif des étapes du système Flp-In dans les cellules Flp-In™ T- REx™ 293 pour la génération de lignées stables. Illustration par ThermoFisher Scientific.

- Constructions plasmidiques

Les deux plasmides utilisés pour créer les lignées stables FLAG-BirA*-PALB2 (GOI1), FLAG- BirA*-NLS (GOI2) ont été créés par clonage des gènes d’intérêt (GOI) (NEB PCR cloning kit, BioLabs) dans la partie N-terminal du plasmide pcDNA5/FRT (Figure 14) en utilisant les amorces JYM3876/ JYM3877 et JYM3760/JYM3761 respectivement. Le plasmide FLAG-BirA*-YFP (GOI3) nous a été fournis par le laboratoire du Dr Nicolas Bisson. Les deux plasmides FLAG-BirA*- NLS et FLAG-BirA*-YFP étaient utilisés pour créer nos lignées stables contrôles pour la BioID.

Figure 14 : Vecteur d’expression pcDNA5/FRT des protéines recombinantes utilisé dans le système Flp-In. Illustration par ThermoFisher Scientific.

- Génération des lignées stables

Les cellules Flp-In™ T-REx™ 293 sont cultivées dans du DMEM complémenté au sérum de veau fœtal à 10% avec 1% de pénicilline/streptomycine, 100 μg/mL Zéocin et 15 μg/mL blasticidine. Après deux à trois jours, quand les cellules atteignent 90% de confluence, ces dernières sont transférées dans des plaques à six puits et cultivées sans marqueurs de sélection à une concentration de 400 000 cellules/puit un jour avant la transfection pour un total de 5 conditions : trois lignées stables GOI1, GOI2, GOI3 (avec les gènes d’intérêt) et deux conditions contrôles GOI-CTL, FLP. Les deux conditions GOI-CTL et FLP sont des contrôles pour toute intégration ou résistance spontanée respectivement. Le lendemain, les vecteurs contenant nos gènes d’intérêt FLAG-BirA*- PALB2 (GOI1), FLAG-BirA*-NLS (GOI2), FLAG-BirA*-YFP (GOI3) sont transfectés chacun en combinaison avec le vecteur pOG44 contenant la recombinase pour un ratio de 1 :10 en utilisant du MIRUS TransIT-293 (MirusBio). Le milieu de culture est changé après 24H et les cellules collectées après 48H et ensemencées dans des pétris de 10 cm. Par la suite, les cellules sont laissées 24 H de plus pour un total de 72H avant l’ajout de l’hygromicine B (100 µg/mL) afin de sélectionner les cellules ayant intégré nos gènes d’intérêt dans chaque condition. La sélection est répétée chaque 3-4 jours jusqu’à formation de colonies visibles dans nos pétris GOI, et mort des cellules contrôles. Les colonies sont laissées en culture jusqu’à ce qu’elles atteignent un diamètre de 3mm pour être sélectionnées encore une fois à l’Hygromicine B tous les 3-4 jours. Pour finir les cellules sont lavées au PBS, trypsinisées pour séparer les cellules des colonies puis ensemencer dans des pétris de 15 cm pour faire des stock de chaque lignée (Flp-In T-REx HEK293 FLAG-BirA*-PALB2, Flp-In T-REx HEK293 FLAG-BirA*-NLS et Flp-In T-REx HEK293 FLAGBirA*-YFP).

Pour finir l’expression de chaque protéine recombinante (FLAG-BirA*-PALB2, FLAG- BirA*-NLS et Flp-In T-REx HEK293 FLAG-BirA*-YFP) est induite à la doxycycline (1 µg/mL) dans chaque lignée correspondante et l’expression est vérifiée par Western-Blot en utilisant l’anticorps FLAG.

- Biotinylation des protéines

Une fois que les lignées stables PALB2,NLS et YFP ont été générées et que leur expression après induction à la doxycycline ait été vérifiée par Western-blot, les cellules sont cultivées dans des pétris de 15 cm. Pour chaque lignée stable deux pétris sont mis en culture, l’un d’eux est par la suite irradié. Les cellules sont laissées en culture jusqu’à ce qu’elles atteignent 70% de confluence (environs 2

jours) puis la doxycycline (1 µg/mL) est ajoutée au milieu pour induction de l’expression de nos protéines. Après 16 heures d’incubation, 50 µM de Biotine est ajoutée au milieu pour chaque pétri juste avant d’irradier les pétris correspondants à 5Gy pour induire les dommages à l’ADN. Les cellules sont collectées après 24 heures dans du PBS 1X, après centrifugation les culots sont conservés à -80°C pour l’analyse.

- Purification par affinité des protéines biotinylées

La purification par affinité des protéines biotinylées sur billes de sépharose conjuguées à la streptavidine nous a permis d’isoler les protéines modifiées par la biotin lors de notre BioID. En effet, la streptavidine est connue pour avoir une très forte affinité pour les molécules de biotin. Pour cela, nos culots de cellules, conservés précédemment à -80 °C, sont lysés dans un tampon RIPA stérile fraichement préparé (50 mM Tris-HCl 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA et 0.1% SDS). Un volume 1 :4 de ce tampon (poids du culot (g) : volume RIPA en mL) supplémenté avec des inhibiteurs de protéases (5 µl/mL, Tablettes Roche) et de 0,5% Sodium deoxycholate est ajouté à chaque échantillon puis le culot re-suspendu pour former un lysat. 250U de benzonase est ajoutée à chaque lysat avant d’incuber les échantillons pendant 30 minutes en rotation à 4°C. Les lysats sont ensuite soniqués dans un Bioruptor (cycle 3x 10 sec ON, 2 sec OFF) puis centrifugés à 16000 g (4°C) pendant 30 minutes. Durant cette étape les billes de sépharose-streptavidine (GE healthcare) sont lavées 3 fois au tampon RIPA et centrifugées pendant 1 minute à chaque fois à une vitesse de 400 g. Après centrifugation le surnageant de chaque échantillon est ajouté aux tubes contenant volume de 30 µl de billes lavées. Les échantillons sont alors incubés à 4°C en rotation pendant au moins 3 heures. Par la suite, les échantillons sont centrifugés à 400 g pendant 1 minute et le surnageant aspiré, puis les billes sont lavées au moins 4 fois avant d’être centrifugées tel que mentionné plus tôt. Les billes sont ensuite lavées 2 fois mais cette fois-ci avec un autre tampon TAP (50 mM HEPES-KOH pH 8.0, 100 mM KCl, 10% glycérol, 2 mM EDTA, 0.1% NP-40) puis 5 fois avec le tampon ABC (50 mM ammonium bicarbonate (0.4g NH4HCO3 /100mL H20 MS Grade). Pour finir, le surnageant est aspiré et les billes réservées presque sèches à -20°C pour l’étape suivante de digestion à la trypsine. La digestion à la trypsine se fait sur les billes directement et inclue une réaction de réduction et d’alkylation, puis les peptides sont prêts à être identifiés en spectrométrie de masse.

Toutes les étapes de digestion ainsi que la spectrométrie de masse était un service offert par Dr François- Michel Boisvert à l’Université de Sherbrooke. L’analyse des données MS a été effectuée par le Dr Jean-Philippe Lambert en utilisant l’algorithme SAINTexpress.197

5. Développement du modèle 3D de sphéroïdes - Lignées et culture cellulaire

Les cellules SKOV3 étaient obtenues de l’American Type Culture Collection ATCC dérivées d’ascite d’ovaire d’un adénocarcinome cultivées dans du milieu McCoy’s 5A. Les DLD1 cellules provenant de l’adénocarcinome colorectal et déficientes ou non en BRCA2 (BRCA2+/- et -/-) ont été reçu de la part du Dr Jean-Yves Bleuyard et cultivées dans du milieu RPMI. Les Hela provenant d’ATCC étaient cultivées dans du DMEM. Les cellules d’ostéosarcome U2OS (HTB-96) achetées auprès de l’America Type Culture Collection (ATCC) etaient maintenues dans du McCoy 5A (Gibco).

Tous les milieux étaient complémentés au sérum de veau fœtal à 10% et 1% de pénicilline/ streptomycine et les cellules cultivées à 5% CO2 et à 37°C.

-Génération des sphéroïdes par la technique de la gouttelette suspendue

La formation de sphéroïdes par la technique de la gouttelette suspendue était possible en utilisant un diapositif commercialisé par 3D Biomatrix qui contient une plaque adaptée Perfecta3D HDPs. Le principe de la technique et les étapes de formation sont illustrés dans la Figure ci-dessous. Pour commencer, les réservoirs représentés dans le schéma ci-dessous (Figure16) sont remplis d’eau, le premier de la plaque de gouttelette avec 2mL et celui du plateau avec 1mL. Le volume est ajusté pour éviter toute contamination et garder un niveau d’humidité qui évitera à nos gouttelettes de sécher. Par la suite, nous préparons la suspension cellulaire à la concentration voulue et disposons 50 µl par puit. Cette technique a été utilisée seulement pour la lignée SKOV3 obtenu à partir de ATCC. La concentration optimale de 12000 cellules/50µl pour la formation d’un sphéroïde dont le diamètre est de 200 µm ou plus a été déterminée après 3 à 4 jours d’incubation en utilisant une gamme allant de 10000 à 20000 cellules par puit. 12000 cellules étaient déposées avec précision sur le bord intérieur de chaque puit comme démontré dans la Figure 16. La plaque est ensuite couverte avec le couvercle et mise dans l’incubateur en évitant toute agitation. Pendant les trois jours le milieu de culture des gouttelettes était renouvelé pour assurer la présence d’assez de nutriment pour la croissance du sphéroïde et évité le shift osmolaire du milieu de culture. Pour cela un volume de 10 µl est pipeté et est ajouté à chaque puit comme montré sur la Figure 16. Après que le sphéroïde soit formé on procède au transfert dans une autre plaque standard de culture et ce en empilant la plaque Perfecta3D HDPs sur cette dernière et centrifugeant à très faible force pour éviter la désintégration du sphéroïde. Les sphéroïdes peuvent ensuite être analysés ou testés dans la plaque de transfert.

Figure 16 : Technique de la gouttelette suspendue pour la formation de sphéroïdes.

Illustration par Perfecta 3D

(A) représentation de la plaque Perfecta3D HDPs et ses constituants : puits de dépôt des goutellettes

(hanging drop plate), Réservoires, Plateau (Tray) et couvercle (Lid). (B) schéma représentant les étapes de la technique pour la formation de la gouttelette. (1) collecte de la suspension cellulaire (50 µl) après préparation de la concentration voulue et insertion de l’embout de la pipette au milieu du puit dirigé vers le bord. (2) Dépôt du volume délicatement. (3) formation de la gouttelette après dépôt de la suspension cellulaire. (C) représentation schématique du changement du milieu de la gouttelette (pipetage et dépôt du nouveau volume).

- Génération des sphéroïdes en utilisant des plaques à adhérence réduite

Nous avons pour cela utiliser les Microplates pour Sphéroïdes de Corning à parois opaques et fonds claires dont la géométrie est arrondie. Le fond du puit possède un revêtement de surface exclusif Corning qui permet la réduction de l’adhésion des cellules tout en favorisant l’agrégation et la

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