Chapitre 4 – Discussion générale
1 La stratégie expérimentale
1.1 Les anticorps
Il n’y a aucune raison de douter de la spécificité des anticorps utilisés au cours des deux volets de cette thèse. Par contre, il est impossible d’affirmer que toutes les terminaisons TH et/ou VGLUT2 ont été identifiées au cours de nos travaux. L’absence de réactivité en immunocytochimie de fluorescence, ainsi qu’en microscopie photonique ou électronique, ne permet pas de conclure à une absence totale d’antigène au sein des éléments examinés. En microcopie électronique, notamment, les problèmes de
pénétration des anticorps et des immunoréactifs compliquent la situation. De plus, le marquage à l’or en pré-enrobage, utilisé pour la visualisation du VGLUT2 lors des doubles marquages est notoirement moins sensible que celui à l’immunoperoxydase- DAB (utilisé pour visualiser la TH).
En théorie, l’immunomarquage TH devrait détecter non seulement les terminaisons axonales DA, mais aussi les terminaisons à noradrénaline (NA) des différentes régions du cerveau. Cependant, ces dernières échappent au marquage lors de l’utilisation des protocoles conventionnels d’immunocytochimie TH, même si les raisons de cet état de fait restent à élucider. De plus, comparativement à leurs homologues DA, les terminaisons NA sont très rares sinon inexistantes dans le NS et peu nombreuses dans le NAC et NAS des rongeurs (Carlsson, 1959; Moore et Card, 1984).
1.2 Les doubles marquages immunocytochimiques
Comme nous l’avons dit ci-dessus, le fait qu’une varicosité axonale ne présente pas d’immunomarquage TH et/ou VGLUT2 n’implique pas nécessairement une absence totale de la protéine en question, car celle-ci pourrait simplement ne pas l’être en quantité suffisante pour être détectée. En revanche, nous avons validé la signification des résultats positifs en double marquage, en montrant que le deuxième marquage est absent lors de l’omission des anticorps primaires ou secondaires correspondants.
En tant qu’élément d’interprétation, il faut aussi tenir compte du fait que le striatum reçoit une forte innervation glutamatergique du thalamus ainsi que du cortex (Hisano et coll., 2000; Bai et coll., 2001; Fremeau et coll., 2001; Herzog et coll., 2001). Ainsi, dans le matériel doublement marqué pour la TH et VGLUT2, devient-il impossible de savoir si les terminaisons striatales immunomarquées seulement pour VGLUT2 sont celles de neurones essentiellement glutamatergiques se projetant à partir du thalamus ou celles de neurones DA du mésencéphale qui ne contiendraient pas du tout ou insuffisamment de TH pour permettre sa détection.
1.3 La quantification des données
À cause des aléas de la fixation chimique et de la pénétration des anticorps dans le tissu préparé pour la microcopie électronique, il est peu probable que toutes les terminaisons TH et/ou VGLUT2 aient été détectées dans l’ensemble du matériel examiné en microscopie électronique. Pour cette raison, dans le premier volet de cette
thèse, nous avons volontairement omis de comparer le nombre de terminaisons appartenant aux diverses catégories de marquage (TH, VGLUT2 et TH/VGLUT2) entre des rats d’âge différent (les jeunes et les adultes). Lors de ces études, cependant, il était possible de comparer le nombre de terminaisons marquées aux deux âges chez les rats lésés à la 6-OHDA durant la période néonatale comparativement aux témoins, en respectant les règles suivantes : confiner l’examen aux régions des coupes fines proches de l’interface tissu-résine; identifier tous les profils de varicosité marqués présents dans ces régions; examiner une surface comparable de coupe fine d’un animal à l’autre; effectuer le dénombrement des différents types de varicosités chez un nombre suffisant d’animaux pour justifier une validation statistique des résultats.
Malgré tout, en coupes fines isolées, les terminaisons axonales les plus volumineuses avaient plus de chance d’être détectées que les plus petites, ce qui était le cas des terminaisons TH/VGLUT2, significativement plus grosses que les terminaisons marquées pour la TH seule. Aussi, en réponse à la demande d’un arbitre lors de la publication de nos premiers résultats, avons-nous appliqué la formule d’Abercrombie (Abercrombie, 1946) au calcul de cette proportion. Cette formule prend en compte l’épaisseur des coupes ainsi que le diamètre moyen des objets observés; elle produit un facteur de correction qui permet d’arriver au « nombre véritable » plutôt qu’au « nombre observé » des objets étudiés (Guillery, 2002). Ainsi, la proportion « corrigée » des terminaisons TH/VGLUT2 est-elle passé de 25% à 28% et de 35% à 37% dans le NAC du raton normal ou 6-OHDA lésé, respectivement, de 17% à 15% dans le NS du raton témoin, et de 46% à 37% dans la SNc du raton 6-OHDA lésé, ce qui, somme toute, ne représente pas une grande différence.
Par contre, lors du deuxième volet de la thèse, nous n’avons pas cherché à comparer le nombre de terminaisons TH, VGLUT2 et TH/VGLUT2 entre les souris VGLUT2 cKO et leurs témoins, jeunes ou adultes. L’objectif était plutôt d’examiner un grand nombre de terminaisons marquées pour la TH seulement dans plusieurs régions du striatum (NAC, NAS, NS), afin de savoir si le knockout conditionnel de VGLUT2 dans les neurones DA entrainait des changements significatif de la morphologie de ces terminaisons. Ici, nous nous sommes donc contentés de photographier un nombre suffisant de terminaisons marquées (environ 30 par région et par souris) pour constituer un échantillon représentatif, quelle que soit la condition expérimentale examinée. Quant
aux expériences de double marquage, elles visaient essentiellement à trouver des terminaisons axonales contenant TH et VGLUT2 chez la souris, pour déterminer si celles-ci seraient toutes synaptiques, tel que précédemment observé chez le raton.
1.4 Morphométrie et extrapolation de l’incidence synaptique
Au cours de ce travail, nous avons pris soin d’obtenir une image de tous les profils de varicosités marqués pour la TH et/ou VGLUT2, c'est-à-dire de tout profil axonal mesurant plus de 0.25 µm de diamètre et contenant un agrégat de vésicules synaptiques, avec ou sans mitochondrie et spécialisation membranaire synaptique.
Les varicosités axonales ont été mesurées pour le diamètre long (L), court (c) et moyen (L + c / 2) à l’aide du logiciel Image J du NIH. Par la suite, nous avons noté la présence et la longueur des jonctions synaptiques, définies par une apposition des membranes plasmiques parallèles et leur épaississement de part et d’autre d’un espace extracellulaire légèrement élargi. La fréquence synaptique observée en coupe fine isolée a été extrapolée au volume entier de la varicosité selon la formule stéréologique de Beaudet et Sotelo (1981), telle que validée par Umbriaco et coll. (Umbriaco et coll., 1994).
Étant donné que les données ont été obtenues en coupes fines isolées, il fallait être conscient du risque de sous-estimer l’incidence synaptique des terminaisons axonales marquées, surtout dans le cas du marquage à l’immunoperoxidase-DAB, qui obscurcit le contenu de la varicosité et peut ainsi rendre difficile la visualisation d’un complexe de jonction synaptique. Aussi, dans le deuxième volet de la thèse où les terminaisons synaptiques sont apparues particulièrement rares, nous avons tenu compte de la diversité d’apparence que peuvent revêtir les complexes de jonction, des plus petits et symétriques aux plus larges et asymétriques (Colonnier, 1968), et retenues comme synaptiques certaines varicosités dont le seul signe de différenciation membranaire synaptique était une petite zone de rectitude et d’apposition parallèle des membranes.