L’expression des isoformes P1 est inhibée par la β-caténine dans le cancer colorectal

isoformes P1 et de l’augmentation des isoformes P2 afin de comprendre la raison de cette différence dans le cancer.

2.1. L’expression des isoformes P1 est inhibée par la β-caténine dans le cancer colorectal

Les résultats précédents ont suggéré que l’expression des isoformes de HNF4α dans les tumeurs et les lignées cancéreuses soit modulée principalement au niveau de leur ARNm. Cette observation suggère que la régulation des isoformes puisse s’effectuer par un mécanisme transcriptionnel et/ou post-transcriptionnel. Cependant, les facteurs de transcription et les micro-ARNs actuellement connus pour réguler HNF4α de façon transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle ne permettent pas d’expliquer la régulation distincte de ses isoformes dans le cancer. Plusieurs de ces facteurs de transcription peuvent en effet réguler les deux promoteurs de HNF4α et leur changement d’expression dans le cancer colorectal survient à une fréquence différente de celle des isoformes P1. De façon similaire, les micro-ARNs régulant HNF4α ciblent des régions communes aux transcrits des isoformes P1 et P2. D’autres facteurs pourraient donc intervenir au niveau du côlon pour réguler leur expression. Les analyses faites précédemment ont montré que l’expression des isoformes P1 est réduite chez les cellules épithéliales au bas des cryptes coliques ainsi

que chez les cellules des tumeurs colorectales. Dans ces deux contextes cellulaires, l’activation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine est connue pour jouer un rôle crucial (Krausova & Korinek, 2014). L’influence possible de la voie Wnt/β-caténine sur l’inhibition des isoformes P1 a donc été investiguée.

Pour déterminer si cette voie est impliquée dans l’inhibition des isoformes P1, l’expression de la β-caténine a été inhibée dans les lignées colorectales Colo205 et DLD-1 à l’aide d’un shARN inductible (Scholer-Dahirel et al., 2011). L’induction du shARN entraîne une diminution presque complète des niveaux de β-caténine active chez les deux lignées après 48 heures (Figure 10A). Cette inhibition de la β-caténine s’accompagne d’une augmentation de l’expression des ARNm des isoformes P1 après 24 heures et atteignant à 48 heures une induction de 4,0 fois et 3,3 fois chez les Colo205 et les DLD-1, respectivement (Figure 10B). En contrepartie, l’expression des isoformes P2 n’est pas influencée par l’inhibition de la β-caténine à l’exception d’une modeste augmentation de 1,5 fois à 48 heures chez les Colo205. Ainsi, l’inhibition de la β-caténine engendre l’augmentation spécifique des niveaux d’ARNm des isoformes P1 chez les lignées colorectales Colo205 et DLD-1. Afin de déterminer si cette augmentation de l’ARNm permet la réexpression des isoformes P1 au niveau protéique, l’immunobuvardage de HNF4α a été effectué après l’induction pendant 48 heures du shARN. Pour la lignée Colo205, la réduction des niveaux de β-caténine active s’accompagne d’une réexpression protéique des isoformes P1 sans influencer le niveau des isoformes P2 (Figure 10C). Cette réexpression des isoformes P1 ne s’aperçoit pas toutefois chez la lignée DLD-1 malgré la réduction des niveaux de la β-caténine active (résultat non montré). Cette lignée à la base exprime par contre de faibles niveaux de HNF4α comparativement aux Colo205 (Figure 9). Ainsi, il est possible que l’augmentation des isoformes P1 observée par qPCR ne conduise pas à des niveaux suffisants d’ARNm après 48 heures pour permettre leur détection par immunobuvardage. Pour vérifier cette hypothèse, l’expression de la β-caténine a été inhibée chez deux autres lignées (Lovo et T84) ayant une expression basale de HNF4α plus élevée que les DLD-1. Bien que le shARN ne réduise pas aussi efficacement les niveaux de β- caténine chez ces lignées, une réexpression ou une augmentation des isoformes P1 est notable par immunobuvardage après 48 heures chez ces lignées (Figure 10D). Ces résultats

Figure 10 : L’inhibition de la β-caténine stimule l’expression des isoformes P1 de HNF4α chez les lignées cancéreuses colorectales.

Les lignées cancéreuses colorectales Colo205 et DLD-1 ont été infectées par des shARN inductibles contre la β-caténine (shβcat) ou une séquence non-spécifique (shCtl) pour produire des lignées stables. A) Les protéines totales de cellules induites 48 heures avec 50 ng/ml de doxycycline ont été extraites et analysées par immunobuvardage. L’expression de la β-caténine active (non-phosphorylée sur Ser33, Ser37 et Thr41) est diminuée chez les cellules exprimant un shARN contre la β-caténine comparativement aux cellules contrôles. B) L’expression de l’ARNm de la β-caténine et des isoformes P1 et P2 de HNF4α a été mesurée par qPCR au cours d’une cinétique d’induction des shβcat et shCtl pendant 48 heures. L’expression de

l’ARNm des isoformes P1 est induite 24 heures après le début de l’inhibition de la β-caténine alors que celle des isoformes P2 demeure stable. L’expression en qPCR a été normalisée aux gènes de référence SDHA et YWHAZ. *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001; ****, p < 0,0001; test t pour échantillons appariés mesuré entre les conditions shCtl et shβcat; n = 3. C) Les protéines totales provenant de Colo205 induite pendant 48 heures avec 50 ng/ml de doxycycline ont été extraites et analysées par immunobuvardage pour visualiser l’expression de la β-caténine active et de HNF4α. La diminution des niveaux de β-caténine active engendre une augmentation des niveaux d’expression des isoformes P1. Résultat représentatif de quatre essais indépendants. D) Les lignées cancéreuses colorectales Lovo et T84 ont été infectées avec le shβcat ou le shCtl puis induites 48 heures avec 50 ng/ml de doxycycline. Les protéines totales ont été extraites et analysées par immunobuvardage pour l’expression de la β-caténine active et de HNF4α. L’inhibition partielle de la β-caténine engendre un début d’augmentation de l’expression des isoformes P1 de HNF4α chez ces lignées colorectales.

démontrent dans leur ensemble que la β-caténine est responsable de l’inhibition des isoformes P1 chez les lignées colorectales et que son inactivation est suffisante pour permettre leur réexpression.

Pour établir si l’inhibition des isoformes P1 par la β-caténine peut également se produire chez les cellules épithéliales in vivo, leur expression a été mesurée dans le contexte des polypes de souris APCmin. Ce modèle murin de polypose intestinale porte une mutation dans un allèle du gène Apc. Lorsque les cellules épithéliales intestinales perdent de façon spontanée le second allèle de type sauvage, la voie de la β-caténine est suractivée et entraîne l’apparition de polypes intestinaux chez la souris. L’expression de HNF4α et de ses isoformes a donc été comparée par qPCR entre les polypes isolés du côlon et leur marge saine adjacente (Figure 11A). Cette analyse révèle que l’expression des isoformes P1 est diminuée de 2,9 fois dans les polypes du côlon alors que celle des isoformes P2 demeure stable. De plus, l’ensemble des transcrits de HNF4α (mesurés par des amorces communes à toutes les isoformes) diminue également d’environ 2,0 fois chez les polypes du côlon. Cette diminution de HNF4α corrèle avec la perte de l’expression des isoformes P1 dans les polypes. Ainsi, l’activation de la β-caténine conduit également à l’inhibition spécifique des isoformes P1 in vivo. Pour vérifier si cette inhibition se reflète au niveau protéique, l’expression des isoformes de HNF4α a été visualisée par immunofluorescence chez les

Figure 11 : L’expression des isoformes P1 de HNF4α est diminuée dans les polypes du côlon chez les souris APCmin.

A) Ratio de l’expression de l’ARNm de HNF4α et de ses isoformes calculé entre les polypes isolées du côlon de souris APCmin et leur marge de résection. *, p < 0,05 sur un test t pour échantillon unique; n = 3 polypes isolés de 3 souris différentes. B) Immunofluorescence des isoformes P1 et P2 sur des polypes de côlons de souris APCmin. P, polype; M, marge saine.

polypes du côlon (Figure 11B). Alors que les cellules épithéliales de la marge expriment les deux classes d’isoformes, seulement l’expression de P2 est maintenue dans les cellules épithéliales des polypes. L’expression des isoformes P1 est diminuée ou absente chez la majorité des cellules composant les polypes confirmant les résultats obtenus en qPCR. Ainsi, l’activation de la voie de la β-caténine dans le contexte des polypes de souris APCmin engendre l’inhibition de l’expression des isoformes P1.

2.2. La β-caténine réprime l’expression des isoformes P1 de HNF4α par un