La β-caténine réprime l’expression des isoformes P1 de HNF4α par un mécanisme

au promoteur

Les résultats obtenus jusqu’à présent démontrent que la β-caténine réprime spécifiquement l’expression des isoformes P1 de HNF4α. Or, la voie de signalisation Wnt/β-caténine est principalement connue pour activer l’expression de ses gènes cibles. Quelques études récentes rapportent toutefois que l’activation de la voie Wnt/β-caténine peut également conduire à la répression de certains gènes cibles (Choi, Estaras, Moresco, Yates, & Jones, 2013; Nishiyama, Skoultchi, & Nakayama, 2012; Smartt et al., 2012). Cette répression peut s’effectuer par différents mécanismes transcriptionnels ou encore post-transcriptionnels selon les gènes cibles.

Pour identifier le mécanisme impliqué dans la répression spécifique des isoformes P1 par la β-caténine, les promoteurs de HNF4A ont tout d’abord été analysés par le logiciel MatInspector (Cartharius et al., 2005) afin de prédire la présence de sites de liaison potentiels pour ses partenaires LEF/TCF. L’analyse des régions -1500 à +200 des TSS suggère la présence de nombreux sites potentiels pour la liaison des facteurs LEF/TCF autant dans le promoteur des isoformes P1 que celui des isoformes P2 (Figure 12A). Cet enrichissement en sites potentiels de liaison suggère que la β-caténine pourrait effectivement réguler l’expression de HNF4α de façon transcriptionnelle. Toutefois, seulement les isoformes P1 sont réprimées par la β-caténine dans le cancer colorectal alors que les deux promoteurs de HNF4α ont des sites de liaison potentiels. Ainsi, la β-caténine pourrait se lier aux deux promoteurs mais pourrait être uniquement active dans le contexte

Figure 12 : L’activité du promoteur P1 et la stabilité de ses ARNm ne sont pas influencés par la β-caténine.

A) Sites potentiels de liaison des facteurs TCF et LEF dans les promoteurs P1 et P2 de HNF4A tel que prédit par le logiciel MatInspector. B) Analyse ChIP des marques d’histones H3K4me3, H3K27Ac et H3K27me3 au niveau des promoteurs P1 et P2 de HNF4A chez les cellules Colo205 et DLD1. Les cellules ont été induites (Dox.) ou non (Veh.) avec 50 ng/ml de

doxycycline pendant 48 heures pour induire ou non l’expression d’un shARN contre la β- caténine. L’activité des promoteurs pour chaque condition a été ensuite évaluée par ChIP des marques activatrices H3K4me3 et H3K27Ac ou inhibitrice H3K27me3 à l’aide d’amorces situées dans la région du TSS. C) Analyse de la stabilité des ARNm des isoformes P1 chez les cellules Colo205 en fonction de l’activité de la β-caténine. La synthèse des ARNm a été bloquée par l’actinomycine D chez les cellules Colo205 exprimant un shARN contre la β- caténine (shβcat) ou contre une séquence non-spécifique (shCtl). Le niveau des ARNm des isoformes P1 a été ensuite mesuré par qPCR à différents temps au cours de la cinétique pour évaluer leur stabilité en fonction de la présence ou l’absence de la β-caténine. L’expression des isoformes P1 a été illustrée en terme de pourcentage relatif au temps 0 de chaque condition. n=3.

du promoteur P1 pour bloquer sa transcription. Afin de vérifier cette hypothèse, l’impact de la perte de la β-caténine sur l’activité de chacun des promoteurs de HNF4α a été déterminé chez les lignées colorectales Colo205 et DLD-1. Pour évaluer l’activité des promoteurs, le patron des modifications d’histones H3K4me3, H3K27Ac et H3K27me3 a été déterminé autour de la région des TSS par essais ChIP. Les promoteurs actifs sont normalement associés à un enrichissement en H3K4me3 et H3K27Ac ainsi qu’à l’absence de H3K27me3 (V. W. Zhou et al., 2011). Les lignées Colo205 et DLD-1 contenant un shARN inductible contre la β-caténine ont été induites 48 heures avec ou sans doxycycline et l’enrichissement des marques H3K4me3, H3K27Ac et H3K27me3 aux promoteurs de HNF4α a été ensuite évalué par ChIP (Figure 12B). Bien que l’inhibition de la β-caténine a engendré l’augmentation attendue des isoformes P1 (résultat non montré), aucun changement majeur dans le patron des modifications d’histones aux promoteurs de HNF4α n’a été observé. À l’état basal (en présence de β-caténine), les promoteurs P1 et P2 sont associés à un état actif puisque les marques H3K4me3 et H3K27Ac sont enrichies avec une absence presque complète de H3K27me3. Toutefois, l’inhibition de la β-caténine par shARN ne change pas les niveaux d’enrichissement de ces marques aux promoteurs P1 ou P2. Ainsi, l’inhibition spécifique des isoformes P1 par la β-caténine ne semble pas s’expliquer par un changement dans l’ouverture de la chromatine au promoteur P1. Il est néanmoins possible que la β- caténine régule l’activité de ce promoteur par un autre mécanisme épigénétique faisant intervenir la méthylation de l’ADN ou la modification des histones sur des régions activatrices en amont (enhancers). Pour vérifier si la β-caténine agit par un tel mécanisme, l’expression des isoformes de HNF4α a été mesurée par RT-PCR chez les lignées

cancéreuses colorectales DLD-1 et Colo205 traitées ou non avec des inhibiteurs d’histones déacétylases et d’ADN méthyltransférases (Annexe 1). La réexpression du promoteur de

CDX1 normalement méthylé chez la lignée DLD-1 démontre que le traitement avec les

inhibiteurs a permis de modifier le contexte épigénétique des lignées colorectales, tel que rapporté précédemment dans la littérature (E. R. Suh, Ha, Rankin, Toyota, & Traber, 2002). L’expression des isoformes P1 n’augmente toutefois que très peu chez les Colo205 suite à l’incubation avec les inhibiteurs et pas du tout chez les DLD-1. La lignée T84 utilisée comme contrôle pour l’expression des isoformes P1 subit quant à elle une faible augmentation similaire à celle des cellules Colo205. Puisque l’inhibition de la β-caténine engendre une forte augmentation de l’expression de l’ARNm des isoformes P1 (Figure 10B), ces résultats semblent insuffisants pour suggérer qu’un mécanisme épigénétique soit en cause.

La possibilité qu’un mécanisme post-transcriptionnel soit responsable du contrôle de l’expression des isoformes P1 par la β-caténine a donc été investiguée par la suite. Il est connu que plusieurs voies de signalisation peuvent réguler HNF4α par l’action de micro- ARNs. Entre autre, l’activation de la voie Wnt/β-caténine dans le foie conduit à l’inhibition de HNF4α par l’induction de mir-34a (Gougelet et al., 2015). Outre l’induction de micro- ARNs, la β-caténine peut aussi contrôler directement la stabilité des ARNm de certaines cibles en s’y liant (Kim, Kwak, Lee, Hyun, & Jeong, 2012). L’ensemble de ces observations suggère donc que la β-caténine pourrait réprimer l’expression des isoformes P1 en affectant la stabilité de leur ARNm. Pour vérifier cette hypothèse, la stabilité des ARNm des isoformes P1 a été mesurée chez la lignée Colo205 en fonction de la présence ou de l’absence de la β-caténine. Des cellules exprimant pendant 48 heures un shARN contre la β-caténine ou contre une séquence non-spécifique (contrôle) ont été exposées à l’actinomycine D pendant 6 heures pour arrêter la transcription des ARNm. Le niveau des ARNm des isoformes de HNF4α a été ensuite quantifié par qPCR à différents temps pour déterminer leur stabilité en fonction de la β-caténine (Figure 12C). Bien que l’expression des isoformes P1 soit augmentée suite à l’inhibition de la β-caténine, aucune différence significative dans la vitesse de dégradation de leur ARNm n’a été observée. Ainsi,

l’inhibition des isoformes P1 par la β-caténine n’implique pas un changement dans la stabilité de leur ARNm.

En somme, l’ensemble de ces résultats n’a pu permettre d’identifier le mécanisme précis par lequel la β-caténine inhibe l’expression des isoformes P1 de HNF4α. Par contre, ces résultats suggèrent que ce mécanisme n’implique pas la stabilité de l’ARNm ou un changement dans l’état de la chromatine au promoteur comme pour plusieurs de ses cibles. La β-caténine inhibe donc l’expression des isoformes P1 par un mécanisme particulier qui demeure à être élucidé.

2.3. L’amplification du gène HNF4A est impliquée dans l’augmentation de