Pour déterminer les partenaires protéiques interagissant avec les isoformes de HNF4α, ceux-ci ont été co-immunoprécipités (Co-IP) avec les isoformes P1 et P2 et ensuite identifiés par spectrométrie de masse quantitative (Figure 18A). Brièvement, des vecteurs lentiviraux contenant la séquence codante de HNF4α2 (classe P1) ou HNF4α7 (classe P2) fusionnée en C-terminal à une étiquette GFP ont été générés et surexprimés dans les lignées 293T et Caco2/15. La lignée rénale embryonnaire humaine 293T a été choisie comme modèle étant donné sa facilité à être infectée et à exprimer de hauts niveaux de protéines recombinantes. Bien qu’elle n’exprime pas HNF4α, son origine épithéliale rénale offre néanmoins un contexte pertinent à sa fonction. La lignée Caco2/15 quant à elle exprime les deux classes d’isoformes de HNF4α offrant un contexte favorable à l’identification de cofacteurs spécifiques aux isoformes P1 et P2 dans le cancer colorectal. Après génération de lignées stables, les cellules ont été cultivées dans des milieux de culture permettant le marquage de leur protéome avec des arginines et lysines de différents poids moléculaires
Figure 18 : Validation des modèles d’expressions HNF4αP1-GFP et HNF4αP2- GFP pour l’identification de partenaires protéiques par immunoprécipitation.
A) Organigramme de la stratégie expérimentale utilisée pour l’identification des partenaires protéiques aux isoformes P1 et P2 de HNF4α. Des cellules 293T et Caco2/15 infectées pour exprimer les constructions HNF4αP1-GFP, HNF4αP2-GFP ou l’étiquette GFP ont été selectionnées afin d’obtenir des lignées stables. Les lignées ont été ensuite cultivées dans du milieu contenant les isotopes SILAC en fonction de leur condition expérimentale (GFP seul =
milieu isotopes légers, HNF4αP1-GFP = milieu isotopes moyens, HNF4αP2-GFP = milieu isotopes lourds). Après le marquage complet des protéines cellulaires avec les isotopes, les protéines nucléaires ont été extraites et les constructions HNF4-GFP immunoprécipitées avec des billes GFP-TRAP. Les protéines co-immunoprécipitées dans les différentes conditions ont été ensuite éluées, combinées et analysées simultanément par spectrométrie de masse en tandem. B) Analyse de l’expression des protéines HNF4αP1-GFP et HNF4αP2-GFP chez la lignée 293T par immunobuvardage. Des extraits de protéines totales provenant de deux infections différentes avec les constructions HNF4α-GFP (P1-GFP ou P2-GFP) ou avec le vecteur contrôle GFP (Ctl GFP) ont été analysés par immunobuvardage à l’aide d’un anticorps anti-GFP. Les protéines de fusion HNF4αP1-GFP et HNF4αP2-GFP sont visibles à 80 kDa et 76 kDa respectivement. Chez les cellules contrôles une bande à la hauteur du poids moléculaire de l’étiquette GFP seule (27 kDa) est visible. C) Analyse de l’expression des protéines HNF4αP1-GFP et HNF4αP2-GFP chez les lignées 293T et Caco2/15 par immunofluorescence. L’expression des constructions HNF4α-GFP a été visualisée à l’aide d’un anticorps dirigé contre l’étiquette GFP (en vert) et les noyaux ont été colorés au DAPI (en bleu). Flèche blanche, forte expression; flèche grise, expression faible; flèche rouge, absence d’expression. D) Expression relative des gènes cibles HNF1A et VIL1 par qPCR chez les cellules 293T exprimant les constructions HNF4α-GFP ou un vecteur contrôle GFP. Expression relative au gène de référence MRPL19. N.D, expression non-détectée; n = 3 pour HNF4αP1-GFP et HNF4αP2-GFP, n= 2 pour Ctl GFP.
selon la méthode SILAC (Stable Isotope Labelling with Amino Acid in Culture). Chaque condition expérimentale a été marquée avec des acides aminés de différents poids moléculaires de façon à pouvoir les distinguer par spectrométrie de masse. Les protéines nucléaires ont été ensuite extraites et HNF4α immunoprécipité par l’étiquette GFP à l’aide d’un fragment d’anticorps de lama immobilisés sur des billes de sepharose. Cette approche, désignée GFP-TRAP, offre deux avantages pour l’identification des partenaires spécifiques aux isoformes de HNF4α. Premièrement, elle permet d’immunoprécipiter avec une affinité similaire les constructions P1 et P2 de HNF4α, ce qui est nécessaire afin de comparer les résultats entre eux. Deuxièmement, l’utilisation d’un fragment d’anticorps de lama permet de réduire considérablement les interactions non-spécifiques détectées en spectrométrie de masse puisque celui-ci est dépourvu des chaînes lourdes et légères communes aux immunoglobulines (Rothbauer et al., 2008). Les protéines qui ont été ainsi co- immunoprécipitées avec les isoformes de HNF4α ont ensuite été identifiées par
spectrométrie de masse et leur enrichissement comparé de façon quantitative grâce au marquage SILAC.
3.2.1.1. Caractérisation des modèles d’expression HNF4α-GFP
Pour valider les modèles d’études, les protéines totales des lignées 293T et Caco2/15 exprimant les constructions HNF4αP1-GFP et HNF4αP2-GFP ont été extraites et analysées par immunobuvardage à l’aide d’un anticorps anti-GFP. Chez la lignée 293T, les deux constructions ont été détectées par immunobuvardage bien que l’expression de HNF4αP2- GFP est deux fois plus forte que celle de HNF4αP1-GFP selon la densitométrie (Figure 18B; ratio densitométrie = 2,2 ± 0,1 (non montré), n=3). Toutefois, l’expression globale des constructions HNF4α-GFP est relativement faible chez les 293T lorsqu’elle est comparée à celle du vecteur contrôle GFP. Au niveau de la lignée Caco2/15, l’expression des protéines de fusion est encore plus faible que chez les cellules 293T prévenant la détection d’expression par immunobuvardage (résultats non-montrés). Ainsi, pour valider l’expression des protéines de fusion et déterminer leur localisation nucléaire, une immunofluorescence dirigée contre l’étiquette GFP a été réalisée (Figure 18C). Les résultats montrent une expression hétérogène des constructions HNF4αP1-GFP et HNF4αP2-GFP chez les deux lignées cellulaires. Bien que certaines cellules montrent un signal relativement fort en immunofluorescence, d’autres sont associées à un marquage faible ou encore nul. Cependant, les deux constructions sont détectées par immunofluorescence chez la lignée Caco2/15. L’intensité plus faible du signal chez les Caco2/15 confirme que l’expression des constructions dans cette lignée est moins élevée que chez les 293T et donc possiblement difficile à détecter par immunobuvardage. De plus, l’intensité globale de l’immunofluorescence de HNF4αP1-GFP est plus faible que celle de HNF4αP2-GFP chez les deux lignées cellulaires confirmant la différence d’expression observée en immunobuvardage. Dans tous les cas, l’expression des protéines HNF4αP1- GFP et HNF4αP2-GFP est majoritairement nucléaire ce qui correspond à la localisation normale de HNF4α chez les cellules. En somme, bien que faible, l’expression des constructions HNF4α-GFP semble suffisante pour permettre la détection d’interactions en spectrométrie de masse tout en limitant les interactions qui pourraient être jugées non-
spécifiques suite à une surexpression atteignant des niveaux bien au delà de ceux normalement retrouvées dans une situation biologique.
Pour vérifier que les protéines de fusion soient toujours aptes à transactiver les gènes, l’expression endogène de gènes connus pour être des cibles directes de HNF4α a été mesurée par qPCR chez les cellules 293T. L’infection par HNF4αP1-GFP ou HNF4αP2- GFP engendre une induction des transcrits des gènes HNF1A et VIL1 qui sont normalement non-exprimés chez les cellules 293T (Figure 18D). De plus, l’induction des gènes HNF1A et VIL1 semble plus élevée chez les cellules exprimant HNF4αP1-GFP que chez celles exprimant HNF4αP2-GFP. Bien que cette différence ne soit pas significative, elle concorde toutefois avec l’activité transcriptionnelle plus élevée reconnue aux isoformes P1 dans la littérature et ce, même si la construction HNF4αP1-GFP est moins exprimée que HNF4αP2-GFP dans les 293T. L’ensemble de ces résultats supporte donc que les protéines de fusion HNF4αP1-GFP et HNF4αP2-GFP reproduisent la fonction de la protéine HNF4α endogène et constitue un système valide pour l’identification de partenaires protéiques par immunoprécipitation.
3.2.1.2. HNF4α interagit avec le suppresseur de tumeur p53 et est associé aux mécanismes de réponse aux dommages à l’ADN
Pour identifier les partenaires protéiques spécifiques aux isoformes P1 et P2 de HNF4α, les lignées 293T et Caco2/15 ont été infectées avec des lentivirus permettant l’expression des constructions HNF4αP1-GFP et HNF4αP2-GFP en comparaison avec un vecteur contrôle menant à l’expression de la GFP seule. Après sélection, les cellules ont été cultivées avec du milieu SILAC afin de marquer le protéome de chaque condition expérimentale avec des acides aminés de différents poids moléculaires (isotopes) pouvant ainsi être différenciés en spectrométrie de masse (Figure 19A). Les protéines nucléaires ont été extraites par une lyse douce pour favoriser le maintien des interactions protéiques et les constructions HNF4α-GFP ont été immunoprécipitées par GFP-TRAP. Les protéines co- immunoprécipitées dans chaque condition expérimentale ont ensuite été regroupées en un
Figure 19 : L’immunoprécipitation des partenaires de HNF4α par GFP-TRAP révèle un grand nombre de protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l’ADN.
A) Schéma expérimental de l’immunoprécipitation des constructions HNF4α-GFP par GFP- TRAP. Des lignées cellulaires exprimant les constructions HNF4αP1-GFP, HNF4αP2-GFP ou GFP seul ont été cultivées dans du milieu de culture contenant des lysines et arginines marquées avec des isotopes de poids moléculaires différents. Les protéines nucléaires ont été
extraites et utilisées pour immunoprécipiter les constructions par l’étiquette GFP à l’aide de billes de sépharose couplées à des fragments d’anticorps de lama. Les protéines co- immunoprécipitées dans chaque condition ont été ensuite mélangées ensemble et analysées simultanément par spectrométrie de masse pour pouvoir comparer l’enrichissement entre les conditions (spectrométrie quantitative). B) Protéines immunoprécipitées avec HNF4αP1-GFP ou HNF4αP2-GFP chez les cellules 293T et Caco2/15. Graphiques représentant le ratio d’enrichissement chez les constructions HNF4α-GFP par rapport au GFP seul. L’intensité en abscisse représente la quantité de protéines enrichies dans l’échantillon. En rouge, HNF4α; En vert, GFP. C) Comparaison des protéines enrichies par HNF4αP1-GFP et HNF4αP2-GFP chez les cellules 293T et Caco2/15. Ratio Lourd/Léger = HNF4αP2-GFP; Ratio Moyen/Léger = HNF4αP1-GFP. En rouge = HNF4α; En vert = GFP.
seul échantillon pour être analysées simultanément par spectrométrie de masse. Les peptides détectés ont alors été comptabilisés en fonction de leur provenance (Ctl GFP, HNF4αP1-GFP, HNF4αP2-GFP) grâce au marquage des acides aminés pour permettre ensuite la comparaison des protéines enrichies dans les immunoprécipitations de façon quantitative.
L’analyse en spectrométrie de masse a détecté 219 protéines dans les échantillons immunoprécipités à partir des cellules 293T et 590 protéines dans ceux immunoprécipités à partir des cellules Caco2/15. Pour distinguer parmi ces protéines celles qui ont été immunoprécipitées spécifiquement par les constructions HNF4α-GFP, leur ratio d’enrichissement a été calculé pour chaque immunoprécipitation par rapport au contrôle GFP. En considérant uniquement les protéines enrichies de 1,5 fois et plus, 7 protéines ont été identifiées par Co-IP avec HNF4αP1-GFP chez la lignée 293T et 19 protéines chez la lignée Caco2/15. Pour les protéines co-immunoprécipitées avec HNF4αP2-GFP, 32 ont été identifiées chez la lignée 293T et 95 chez la lignée Caco2/15 (Figure 19B). HNF4α a été identifié comme la protéine la plus enrichie dans tous les cas confirmant que les immunoprécipitations ont bien fonctionné.
Pour identifier parmi ces protéines de potentiels partenaires d’interactions spécifiques aux isoformes P1 ou P2, l’enrichissement des protéines co-immunoprécipitées avec HNF4αP1-GFP et HNF4αP2-GFP a été comparé (Figure 19C). De façon inattendue, aucun
partenaire spécifique n’a été identifié pour HNF4αP1-GFP quoique plusieurs partenaires communs ou spécifiques à HNF4αP2-GFP furent identifiés dans les deux lignées. Cette observation combinée au fait que davantage de partenaires ont été co-immunoprécipités avec HNF4αP2-GFP qu’avec HNF4αP1-GFP suggère un biais expérimental. D’ailleurs, l’enrichissement de HNF4α est supérieur chez les immunoprécipitations de HNF4αP2-GFP comparativement à celles de HNF4αP1-GFP (1,7 fois plus chez les 293T et 2,9 fois plus chez les Caco2/15). Ainsi, l’expression plus faible de la construction HNF4αP1-GFP dans les lignées cellulaires (voir figure 18B et C) semble avoir défavorisé l’immunoprécipitation de ses partenaires. Ce biais technique permet difficilement d’utiliser les résultats obtenus avec cette construction et rends impossible l’identification de partenaires spécifiques tel que prévu initialement. Toutefois, puisque les isoformes P2 sont celles majoritairement exprimées dans le cancer colorectal et que l’immunoprécipitation de la construction HNF4αP2-GFP semble avoir bien fonctionnée, nous avons poursuivi notre étude dans le but d’identifier leurs partenaires d’interactions.
Afin d’identifier les rôles potentiels des isoformes P2, l’ensemble des protéines co- immunoprécipitées par la construction HNF4αP2-GFP a été analysé avec les logiciels PANTHER (Mi, Muruganujan, & Thomas, 2013) et DAVID (Huang, Sherman, & Lempicki, 2009) pour déterminer leurs fonctions biologiques (Figure 20). Chez les deux lignées cellulaires, le tiers des partenaires identifiés sont des protéines liant les acides nucléiques. Parmi ceux-ci, plusieurs facteurs de transcription ou cofacteurs ont été identifiés dont p53, β-caténine, NKRF, RBM14, PC4, HLTF, BRG1, ISWI et ARGLU1. À ce titre, le facteur de transcription p53 et le cofacteur PC4 sont des protéines connues pour interagir avec HNF4α (Green et al., 1998; Maeda et al., 2002). De plus, les protéines nucléophosmine (NPM1) et HSPA9 qui ont été co-immunoprécipitées avec HNF4α sont des partenaires connus de p53 pouvant moduler son activité. Les isoformes P2 de HNF4α semblent donc associées à la régulation de p53 par interaction directe ou indirecte via la nucléophosmine ou HSPA9. Chez la lignée 293T, les isoformes P2 interagissent également avec un groupe de protéines histones enrichies de façon similaire (Figure 19C et Figure 20). Cet enrichissement d’histones, incluant H2A, H2B, H3 et H4, suggère que les isoformes P2
Figure 20 : Fonctions cellulaires associées aux partenaires protéiques des isoformes P2 de HNF4α chez les 293T et Caco2/15.
Les protéines co-immunoprécipitées avec la construction HNF4αP2-GFP ont été analysées par les logiciels PANTHER et DAVID pour identifier respectivement leurs classes et leurs fonctions. Les partenaires protéiques des isoformes P2 sont associés à la réponse aux dommages à l’ADN et à la transcription chez les deux lignées cellulaires. Chez les 293T, les isoformes P2 interagissent avec les nucléosomes alors qu’une interaction avec de nombreuses molécules de jonctions a été identifiée chez les Caco2/15. Les encadrés correspondent aux protéines identifiées dans chaque catégorie avec leur ratio d’enrichissement.
pourraient interagir avec les nucléosomes. Au niveau de la lignée Caco2/15, un grand nombre de molécules de jonctions ont été co-immunoprécipitées dont l’α-caténine, la β- caténine, la cinguline et ZO-1 (Figure 19C et 20). La présence de ces protéines, ainsi que de plusieurs plakophilines, est surprenante étant donné que HNF4α est normalement localisé au noyau et que les immunoprécipitations ont été effectuées sur des extraits nucléaires. Ces interactions pourraient néanmoins révéler un nouveau mode de régulation pour les isoformes P2 puisque l’α-caténine, ZO-1 et les plakophilines ont tous été rapportés pour pouvoir influencer l’activité de divers facteurs de transcription par des interactions directes (Balda & Matter, 2000; McCrea & Gottardi, 2016; Munoz et al., 2014; Remue et al., 2010).
En plus de ces interactions, un grand nombre de protéines associées aux dommages à l’ADN ont été co-immunoprécipitées avec les isoformes P2 chez les deux lignées cellulaires. En effet, PARP1, RAD50 et USP7 ont été identifiés chez les cellules 293T ainsi que MSH2, SFPQ et RBM14 chez les cellules Caco2/15. De plus, chez les deux lignées cellulaires la protéine PRKDC, considérée comme un détecteur moléculaire des dommages à l’ADN, et la protéine NONO, impliquée dans la réparation des dommages double brin de l’ADN, ont été co-immunoprécipitées avec HNF4αP2-GFP. Ces interactions retrouvées chez les deux lignées cellulaires suggèrent un rôle inattendu des isoformes P2 dans les mécanismes de réponse aux dommages à l’ADN.
En somme, bien que des limitations techniques ont empêché de comparer les partenaires spécifiques des classes d’isoformes de HNF4α, de nouveaux partenaires ont toutefois été identifiées pour les isoformes P2. Ces découvertes suggèrent que le changement d’expression des isoformes de HNF4α dans le cancer colorectal pourrait influencer la fonction du suppresseur de tumeur p53 ainsi que les mécanismes de réponse aux dommages à l’ADN nécessaires à la survie des cellules cancéreuses.
3.2.2. Identification par BioID des protéines pouvant interagir avec les isoformes P2 de HNF4α in vivo chez les cellules 293T et HCT116
Les résultats précédents ont identifié de nouveaux rôles potentiels pour les isoformes P2 dans la réponse aux dommages à l’ADN et dans l’activité de p53; deux processus jouant des rôles majeurs dans la carcinogénèse colorectale. Cependant, aucun des principaux cofacteurs de HNF4α n’a été identifié avec la méthode GFP-TRAP. Cela suggère que les conditions d’extraction pour l’immunoprécipitation n’ont pas permis de conserver les interactions plus faibles des isoformes P2 avec certains de leurs partenaires. Pour contourner cette limitation expérimentale, les partenaires interagissant avec les isoformes P2 ont été analysés avec la méthode de marquage in vivo BioID où les interactions protéiques ne dépendent pas des conditions d’extraction.
Cette méthode permet d’identifier les protéines interagissant ou situées à proximité des isoformes P2 dans les cellules contrairement aux immunoprécipitations classiques qui doivent obligatoirement maintenir le plus fidèlement possible les interactions naturelles lors des premières étapes de préparation des extraits protéiques. Cette méthode repose sur le marquage in vivo à la biotine des protéines venant en contact à un moment ou à un autre avec les isoformes P2 pour être ensuite isolées et identifiées par spectrométrie de masse (Figure 21A). Brièvement, un vecteur lentiviral contenant la séquence codante de HNF4α7 (classe P2) fusionnée en C-terminal avec la biotine ligase BirA de E. coli a été généré (HNF4αP2-BirA). Des cellules infectées par HNF4αP2-BirA ou un vecteur vide ont été ensuite cultivées en milieu SILAC. Après sélection, les cellules ont été incubées 24 heures en présence de biotine pour permettre à l’enzyme BirA de marquer les protéines situées à proximité de HNF4αP2-BirA in vivo. Cette enzyme convertie la biotine en biotinoyl-5’- AMP réactive qui peut interagir alors avec les lysines des protéines avoisinantes. Puisque la molécule biotinoyl-5’-AMP est instable, la biotinylation a lieu principalement sur les protéines situées à proximité de l’enzyme; c’est-à-dire les protéines interagissant directement ou indirectement avec HNF4αP2-BirA. Les protéines marquées sont ensuite immunoprécipitées à partir d’extraits nucléaires par des billes couplées à la streptavidine et finalement identifiées par spectrométrie de masse. Les partenaires in vivo des isoformes P2
Figure 21 : Identification in vivo des protéines à proximité des isoformes P2 de HNF4α par BioID.
A) Schéma expérimental de la méthode BioID pour l’identification des protéines voisines aux isoformes P2 de HNF4α in vivo. Les lignées 293T ou HCT116 ont été infectées pour exprimer une construction de HNF4αP2 fusionnée en C-terminal à l’enzyme biotine ligase BirA (HNF4αP2-BirA) ou un vecteur vide contrôle. Pour différencier en spectrométrie de masse les protéines provenant des différentes conditions, les cellules ont été cultivées dans du milieu de culture contenant des lysines et arginines de poids moléculaires différents (SILAC). Les cellules ont été alors incubées 24 heures en présence de biotine pour permettre la biotinylation des protéines par l’enzyme BirA. Les protéines nucléaires ont été ensuite extraites et incubées avec des billes couplées à la streptavidine pour isoler l’ensemble du protéome nucléaire qui a
été biotinylé. Les échantillons des cellules contrôles ou exprimant HNF4αP2-BirA ont été mélangés pour être analysés simultanément par spectrométrie de masse quantitative. L’enrichissement en protéines marquées à la biotine chez les cellules HNF4αP2-BirA a été ensuite calculé à partir du marquage moléculaire des les lysines et arginines. B) Validation du modèle HNF4αP2-BirA par qPCR. Des cellules 293T exprimant la construction HNF4αP2- BirA ou un vecteur vide ont été analysées par qPCR pour vérifier l’induction des gènes cibles HNF1A et VIL1. Expression relative au gène de référence MRPL19. n =1. C) Distribution des protéines marquées à la biotine et IP par les billes de streptavidine chez les cellules 293T et HCT116 HNF4αP2-BirA. Graphique représentant l’enrichissement des protéines pour HNF4αP2-BirA comparativement aux cellules contrôles (vecteur vide) et illustré en fonction de leur intensité en spectrométrie de masse. Les protéines enrichies de 1,5 fois et plus (ligne pointillée) sont considérées comme spécifiquement marquées par HNF4αP2-BirA.
peuvent alors être déterminés en comparant de façon quantitative (SILAC) leur enrichissement chez les cellules HNF4αP2-BirA comparativement aux cellules contrôles.
Pour réaliser l’essai BioID, les lignées 293T et HCT116 ont été infectées avec le vecteur HNF4αP2-BirA ou un vecteur vide contrôle. La lignée HCT116 a été utilisée comme modèle cancéreux colorectal humain puisque les expériences précédentes ont démontré que les protéines de fusion ne sont que faiblement exprimées chez la lignée Caco2/15. De plus, la lignée HCT116 à l’avantage d’exprimer un p53 sauvage comme les cellules 293T où l’interaction entre HNF4α et p53 a été détectée précédemment. Pour valider la fonctionnalité de la construction HNF4αP2-BirA, l’expression des gènes cibles