Le cancer colorectal est associé à l’inhibition de l’expression des isoformes P1 et au

Les résultats précédents démontrent que l’expression des isoformes de HNF4α varie le long des cryptes du côlon. Dans le cancer colorectal, l’expression de HNF4est également connue pour varier. Les tumeurs colorectales présentent fréquemment une induction de l’expression de HNF4α au niveau de l’ARNm et de la protéine (Mathieu Darsigny et al., 2010). Étrangement, plusieurs études d’immunohistochimie rapportent

toutefois une diminution des isoformes P1 dans les tumeurs colorectales (Chellappa et al., 2012; Tanaka et al., 2006). Afin de clarifier cette situation et d’identifier les isoformes de HNF4 impliquées dans le cancer colorectal, les niveaux d’expression de leur ARNm ont été comparés par qPCR entre les tumeurs et les marges de résection obtenues de 67 patients atteints du cancer colorectal (Figure 8A). La majorité des patients (91%) ont une diminution de plus de 2 fois des niveaux d’expression des isoformes P1 dans leur tumeur. Parmi ceux-ci, 68% ont même une réduction de plus de 5 fois des niveaux d’ARNm des isoformes P1. L’expression des isoformes P1 est donc fortement inhibée dans les tumeurs colorectales comparativement à la marge saine. En contrepartie, le niveau d’expression des ARNm des isoformes P2 de HNF4α dans les tumeurs demeure stable (variation de moins de 0,5 fois) ou augmente (> 1,5 fois) chez 82% des patients. Ainsi donc, le cancer colorectal est associé à l’inhibition des isoformes P1 et au maintien ou encore une augmentation des isoformes P2 de HNF4α dans les tumeurs.

Pour valider ces résultats au niveau protéique, l’expression de HNF4α et de ses isoformes a été évaluée par immunofluorescence dans les tumeurs colorectales de 36 patients. Bien que l’ensemble des cellules cancéreuses des tumeurs expriment HNF4α (anticorps polyclonal reconnaissant toutes les isoformes), la co-immunofluorescence avec des anticorps spécifiques révèle que seulement les isoformes de la classe P2 sont présentes (Figure 8B). L’expression des isoformes P1 au niveau protéique est très faible voire non détectable chez la majorité des tumeurs colorectales. L’expression des isoformes a été ensuite comparée entre les tumeurs et les marges de résection chez les 36 patients pour valider leur inhibition ou leur augmentation dans le cancer (Figure 8C). L’expression de chaque classe d’isoformes a été évaluée de manière qualitative à partir d’un score basé sur l’intensité du signal de fluorescence et sur la proportion de cellules (épithéliales ou cancéreuses) marquées dans l’ensemble du tissu. Conformément aux résultats précédents, l’expression protéique des isoformes P1 est diminuée chez la majorité (78%) des tumeurs colorectales. Par contre, 92% des tumeurs présentent un maintien ou une augmentation de l’expression des isoformes P2 comparativement à leur marge de résection. L’ensemble de ces résultats démontre que l’expression des isoformes P1 est inhibée dans le cancer colorectal alors que celle des isoformes P2 est maintenue ou augmentée.

Figure 8 : Le cancer colorectal est associé à l’inhibition des isoformes P1 et le maintien des isoformes P2.

A) Modulation des niveaux d’ARNm des isoformes de HNF4α dans les tumeurs colorectales. Le ratio d’expression des isoformes P1 et P2 a été mesuré par qPCR chez les tumeurs et les marges de résection de chaque patient. L’expression de l’ARNm des isoformes P1 diminue dans les tumeurs chez la majorité des patients alors que l’expression des isoformes P2 demeure stable ou est augmentée. Section rouge = augmentation dans les tumeurs; Section bleue = diminution dans les tumeurs. En rouge apparaît la moyenne ± SD (n = 67); ***, p < 0,001; **,

p < 0,01. B) Co-immunofluorescence de HNF4α et de ses isoformes chez les tumeurs colorectales. L’expression et la localisation de HNFα dans les tumeurs ont été observées à l’aide d’un anticorps reconnaissant l’ensemble de ses isoformes (HNF4α; orange) ou seulement la classe P1 ou P2 (Isoformes spécifiques; vert). Bien que l’ensemble des cellules tumorales exprime HNF4α, seulement les isoformes P2 contribuent à son expression (cellules apparaissant jaune-orange en colocalisation) puisque les isoformes P1 ne sont pas détectées. Illustration d’un exemple représentatif de la majorité des tumeurs analysées. C) Comparaison de l’expression protéique des isoformes de HNF4α entre les tumeurs et leur marge de résection chez les patients atteints du cancer colorectal. L’expression des isoformes de HNF4α a été évaluée par immunofluorescence et classée selon un score de 0 à 2 définissant l’intensité de fluorescence et la proportion de cellules marquées dans le tissu (0 = absence ou faible expression, 1 = expression intermédiaire, 2 = expression forte). Les cases bleues correspondent aux patients ayant une diminution d’expression dans la tumeur et les cases rouges une augmentation d’expression dans la tumeur. L’expression protéique des isoformes P1 dans la tumeur est diminuée chez la majorité des patients alors que celle des isoformes P2 augmente chez la majorité des patients. n = 36.

Plusieurs lignées cancéreuses colorectales ont été par la suite analysées pour vérifier le patron d’expression des isoformes de HNF4. L’expression de HNF4 a été vérifiée tout d’abord dans un éventail de lignées cancéreuses colorectales par immunobuvardage sur des extraits totaux. L’expression de HNF4α a été détectée chez toutes les lignées analysées à l’exception des HCT116 (Figure 9A). La vérification subséquente des données disponibles par le Cancer Cell Line Encyclopedia project (Barretina et al., 2012) suggère toutefois que cette lignée possède une délétion dans le gène HNF4A expliquant son absence d’expression. Les autres lignées se classent en deux groupes selon le niveau d’expression de HNF4α détecté en immunobuvardage (Figure 9A). Les lignées Caco2/15, T84, Colo205 et Lovo font parties d’un groupe exprimant fortement HNF4 alors que les lignées DLD1, HT-29 et SW480 font parties d’un groupe l’exprimant plus faiblement. Toutefois, peu importe le niveau d’expression de HNF4, les isoformes P2 sont les isoformes majoritairement exprimées par toutes les lignées colorectales (Figure 9A). Les isoformes P1 quant à elles sont plus faiblement exprimées et détectables uniquement chez les lignées exprimant fortement HNF4α. De manière intéressante, les deux principales lignées exprimant des isoformes P1 sont les Caco2/15 et T84 qui conservent respectivement la

capacité de se différencier ou de se polariser en culture. En second lieu, les ARNm des classes d’isoformes P1 et P2 ont été quantifiés par qPCR pour déterminer l’origine de leur expression différente dans les lignées cancéreuses colorectales (Figure 9B). À l’image des résultats obtenus par immunobuvardage, l’ARNm de HNF4A est exprimé à différents niveaux chez les lignées cancéreuses. Les lignées ayant une forte expression de HNF4 en protéine (Caco2/15, T84, Colo205 et Lovo) sont également celles avec les niveaux les plus élevés d’ARNm. De plus, l’expression de l’ARNm des isoformes P1 est détectée que chez les lignées qui expriment la protéine par immunobuvardage, soit les Caco2/15, T84 et Colo205. Finalement, le niveau d’expression des ARNm des isoformes P2 corrèle également avec le niveau de protéine dans les lignées cancéreuses. En effet, les Caco2/15 et T84 qui ont la plus forte expression en immunobuvardage ont également la plus forte expression en qPCR (Figure 9A et 9B). À l’inverse, les DLD1, HT-29 et SW480 ont la plus faible expression en immunobuvardage et en qPCR. Ainsi, la grande corrélation observée entre les niveaux d’expression de la protéine et de l’ARNm dans les lignées cancéreuses colorectales suggère que c’est au niveau de l’ARNm que les isoformes de HNF4alpha sont principalement régulées.

En somme, les résultats des analyses effectuées chez les tumeurs colorectales et les lignées cancéreuses démontrent que l’expression des isoformes P1 est inhibée dans le cancer colorectal alors que celle des isoformes P2 est maintenue ou augmentée. Ce patron d’expression se présente comme une caractéristique récurrente dans le cancer colorectal et les lignées cellulaires associées. Il diverge de la normalité où l’expression des isoformes P2 dans les cellules prolifératives de la crypte est graduellement remplacée par celle des isoformes P1 chez les cellules différenciées. Cette différence d’expression entre les isoformes suggère donc des rôles distincts pour celles-ci ainsi que des mécanismes de régulation de leur expression distincts dans le cancer.

Figure 9 : Les lignées cancéreuses colorectales expriment majoritairement les isoformes P2 de HNF4α.

A) Expression protéique de HNF4α chez les lignées cancéreuses colorectales. Des extraits de protéines totales ont été récoltés de différentes lignées cancéreuses colorectales sous- confluentes et analysés par immunobuvardage à l’aide d’un anticorps reconnaissant toutes les isoformes de HNF4α. Deux temps d’exposition (15 et 180 secondes) ont été utilisés pour couvrir les différents niveaux d’expression de HNF4α entre les lignées. Toutes les lignées cancéreuses colorectales expriment majoritairement les isoformes P2 de HNF4α bien que les Caco2/15, T84 et Colo205 expriment aussi les isoformes P1 à des niveaux plus faibles. La lignée HCT116 qui porte une délétion dans le gène HNF4A n’exprime quant à elle aucune isoforme. B) Expression relative de l’ARNm de HNF4A et de ses isoformes dans les lignées cancéreuses colorectales. L’ARN de différentes lignées cancéreuses colorectales sous-

confluentes a été extrait et analysé par qPCR pour quantifier l’expression globale de HNF4A ou l’expression spécifique des classes d’isoformes P1 ou P2. Expression relative aux gènes de référence MRPL19, RPL13A et SDHA. Moyenne ± SD; n=3 (sauf SW480 où n=2); N.D, expression non détectée.

2. Identifier les mécanismes de régulation responsables de l’expression distincte des