Légendes des figures

Figure 1: Implication de GSK3β et des intégrines α4 et α5 dans la survie des cellules leucémiques adhérentes. A. Cytométrie en flux. Après nucléofection avec des siRNA dirigés

contre les intégrines, les cellules U937 transfectées, à 48 h pour l’intégrine α4 et à 96 h pour l’intégrine α5, sont analysées par cytométrie en flux, après un marquage avec les anticorps dirigés contre α4 et α5. Les résultats sont comparés aux cellules U937 transfectées avec le siRNA contrôle et sont représentatifs de deux expériences indépendantes. Le pourcentage de baisse d’intensité de fluorescence est indiqué. Immunoempreinte. 48 h après nucléofection, les cellules U937 transfectées avec le siRNA GSK3β sont analysées par immunoempreinte. Les résultats sont comparés aux cellules U937 transfectées avec le siRNA contrôle et ils sont représentatifs de trois expériences indépendantes. L’actine est montrée en tant que témoin de dépôt. B. Les cellules U937, transfectées avec les siRNA, sont privées en sérum pendant une heure, 48 h après nucléofection pour le siGSK3β et le siα4 et 96 h pour le siα5, et mises en adhésion pendant une heure sur fibronectine. Après une nuit d’incubation en présence de 10 % de sérum, le nombre de cellules vivantes est quantifié par un test MTT. Les résultats sont exprimés en pourcentage comparé aux contrôles respectifs en Suspension ou en Adhésion (siRNA contrôle) et sont représentatifs de six expériences indépendantes. **P<0.001, *P<0.05. C. Les cellules U937 transfectées avec le siRNA α5, 96 h après nucléofection, sont déprivées une heure en sérum et mises une heure en adhésion sur fibronectine. Après un marquage annexine V/iodure de propidium (IP), les cellules sont passées au cytomètre en flux, puis analysées en terme de pourcentage de cellules en apoptose et de cellules en nécrose. Les résultats sont comparées aux cellules U937 transfectées avec le siRNA contrôle et ayant subi le même traitement.

Figure 2: Régulation différentielle de GSK3β par les intégrines α4 et α5 dans les cellules leucémiques. A. Les cellules U937 transfectées avec le siRNA intégrine α4 ou α5 sont

analysées par immunoempreinte, 48 h ou 96 h après nucléofection, respectivement. Des immunoempreintes sont réalisées vis-à-vis des intégrines α4 et α5, et de GSK3β. Les résultats sont comparés aux cellules U937 transfectées avec le siRNA contrôle. L’actine est représentée en tant que contrôle des dépôts. B. Les cellules U937 transfectées avec les siRNA des intégrines α4 et α5 sont prélevées à 48 h et 96 h, respectivement, déprivées 1 h en sérum, et sont mises en adhésion sur fibronectine 1 h, à 37°C (A-SVF), ou maintenues en suspension

(S-SVF). Après la réalisation de lysats cellulaires, des immunoempreintes sont effectuées vis- à-vis de GSK3β, phospho (S9) GSK3β, phospho (Y216) GSK3β et les intégrines α4 et α5 (voir le panel, où GSK3β est le témoin de dépôt).

Figure 3: Implication de l’intégrine α5 et de PP2A dans la régulation de GSK3β et dans la survie des cellules leucémiques. A. Les cellules U937 transfectées avec un siRNA α5 ou

PP2A (dirigé contre la sous-unité régulatrice de PP2A, PP2A-B’) sont recueillies à 96 h et 72 h, respectivement, et déprivées 1 h en sérum. Elles sont ensuite mises en adhésion sur fibronectine 1 h à 37°C, ou maintenues en suspension, puis toutes les cellules (en adhésion et en suspension) sont incubées toute la nuit avec 10 % de sérum. Des cellules U937 non transfectées sont traitées de façon identique, après incubation avec l’acide okadaïque (100 nM) pendant l’heure de déprivation sérique. A 24 h, les cellules vivantes sont estimées par un test MTT. Les résultats sont exprimés en pourcentage de survie par rapport au contrôle en suspension et sont représentatifs de trois expériences indépendantes, pour les cellules siRNA PP2A et traitées avec l’acide okadaïque, et de six pour les cellules siRNA α5. **P<0.001.

Panel : 72 h après nucléofection, le taux de PP2A-B’ est évalué par immunoempreinte pour

tester l’efficacité du siRNA. B. 72 h ou 96 h après nucléofection, les cellules U937 transfectées avec le siRNA PP2A-B’ ou intégrine α5, respectivement, sont reprises dans du tampon Laemmli et analysées par immunoempreinte, pour l’intégrine α5, PP2A-B’, GSK3β, et sa forme phosphorylée sur sérine 9. Les résultats sont comparés aux cellules transfectées avec le siRNA contrôle. Le taux d’actine témoigne de l’homogénéité des dépôts.

Figure 4: Co-localisation de l’intégrine α5 et de la phosphatase PP2A dans les cellules leucémiques. Les cellules U937 sont déprivées 1 h en sérum, puis mises en adhésion (A-

SVF) ou non (S-SVF) sur une matrice de fibronectine pendant 1 h. Elles sont ensuite marquées par immunofluorescence avec les anticorps dirigés contre l’intégrine α5 et la sous- unité catalytique de la phosphatase PP2A. Ces images sont représentatives de deux expériences indépendantes et correspondent au phénotype observé dans plus de 90 % des cellules de la lame.

Figure 5: Localisations différentielles de PP2A et de GSK3β et régulation de GSK3β dans des cellules leucémiques en suspension ou en adhésion. A. Les cellules U937 sont

marquées par immunofluorescence avec les anticorps dirigés contre PP2A et GSK3β. Panel

de gauche. Le graphique représente le pourcentage moyen de chaque protéine présente dans le

noyau, en adhésion et en suspension, dans plus de 80% des cellules de la lame. Panel de

droite. Le graphique représente le pourcentage moyen de co-localisation des deux protéines

dans la cellule, en adhésion et en suspension, dans plus de 80% des cellules de la lame. B. Après la déprivation sérique, suivie (A-SVF) ou non (S-SVF) de l’adhésion sur matrice de fibronectine, les cellules U937 subissent un fractionnement pour obtenir les protéines des compartiments cytosolique (C) et membranaire (Mb). Les immunoempreintes sont réalisées vis-à-vis de GSK3β et de sa forme phosphorylée sur sérine 9, ainsi que pour l’intégrine α5. L’actine est montrée en tant que témoin de dépôt.

Figure 6: Activation de Pyk2 lors de l’adhésion des cellules leucémiques sur fibronectine et contrôle de leur survie par Pyk2. A. Les cellules U937 sont déprivées en sérum et soit

mises en adhésion (A-SVF), soit laissées en suspension (S-SVF). D’autres cellules sont cultivées dans des conditions basales en sérum (S+SVF). Des immunoempreintes sont réalisées avec des anticorps dirigés contre Pyk2, et sa forme phosphorylée sur tyrosine 402, à partir des lysats obtenus pour chaque essai. L’actine représente le témoin de dépôt. B. Les cellules U937 transfectées avec un siRNA contre Pyk2 sont recueillies 48 h après nucléofection, puis traitées dans les conditions adhésives (A-SVF) ou de suspension (S-SVF), toujours après 1 h de déprivation sérique. Ensuite, toutes les cellules (en adhésion et en suspension) sont incubées toute la nuit avec 10 % de sérum. Les cellules vivantes sont estimées par un test MTT. Les résultats sont exprimés en pourcentage de survie par rapport au contrôle en suspension et sont représentatifs de cinq expériences indépendantes. **P<0.001.

Panel. 48 h après nucléofection, le taux de Pyk2 est recherché par immunoempreinte pour

tester l’efficacité du siRNA Pyk2, qui a été réalisé par électroporation avec un siRNA « smart pool » comme indiqué dans le Matériels et Méthodes.

Figure 7: Régulation de Pyk2 par l’intégrine α4 dans les cellules leucémiques. A. 48 h

après nucléofection, les cellules U937 transfectées avec un siRNA dirigé contre l’intégrine α4 sont privées pendant 1 heure de sérum, puis mises en adhésion sur fibronectine, pendant 1 heure. L’évaluation de l’expression de l’intégrine α4 et de la phosphorylation sur tyrosine 402 de Pyk2 est réalisée par immunoempreinte et comparée avec les cellules U93 transfectées avec un siRNA contrôle, après le même traitement. Le taux d’actine sert de contrôle pour

l’homogénéité des dépôts. B. Les cellules U937 sont traitées dans des conditions adhésives (A-SVF) ou de suspension (S-SVF), puis marquées par immunofluorescence avec les anticorps dirigés contre Pyk2 et l’intégrine α4. Ces images sont représentatives de deux expériences indépendantes et correspondent au phénotype de plus de 90 % des cellules de la lame.

Figure 8: Régulation de la phosphorylation de la tyrosine 216 de GSK3β par Pyk2 dans les cellules leucémiques. 48 h après nucléofection, les cellules U937 transfectées avec le

siRNA Pyk2 sont recueillies pour obtenir des lysats cellulaires. Par immunoempreinte, le taux de phosphorylation sur tyrosine 216 de la kinase GSK3β et celui de GSK3β sont révélés. Les résultats sont comparés aux cellules transfectées avec le siRNA contrôle. Le taux d’actine représente le témoin de dépôt.

Figure 9: Co-localisation de Pyk2 et de Ptyr GSK3 dans les cellules leucémiques adhérentes. Les cellules U937 sont traitées dans des conditions adhésives (A-SVF) ou de

suspension (S-SVF), puis marquées par immunofluorescence avec les anticorps dirigés contre Pyk2 et phospho-tyrosine (Y279/216) GSK3α/β (GSK3 tyr). Panel de gauche. Le graphique représente le pourcentage moyen de chaque protéine présente dans le noyau, en adhésion et en suspension, dans plus de 80 % des cellules. Panel de droite. Le graphique représente le pourcentage moyen de co-localisation des deux protéines dans la cellule, lors des deux conditions expérimentales, dans plus de 80 % des cellules de la lame.

4. Conclusion et discussion

Dans un modèle de survie au stress de déprivation sérique, nous démontrons que les cellules leucémiques U937 mettent en place une voie de signalisation spécifique, après adhésion sur une matrice de fibronectine. Cette voie implique essentiellement l’activation de la kinase GSK3β par sa déphosphorylation sur sérine 9, induite par la phosphatase PP2A après engagement de l’intégrine α5β1. Cependant, l’autre intégrine récepteur de la fibronectine, α4β1, semble jouer un rôle complémentaire majeur qui est de maintenir un niveau basal d’expression de GSK3β, et de favoriser la localisation nucléaire de sa forme activée tyrosine phosphorylée, en coopération avec la tyrosine kinase Pyk2.

Les résultats obtenus démontrent que, lorsque les cellules U937 sont en suspension, la phosphatase PP2A co-localise avec l’intégrine α5 et GSK3β, respectivement à la membrane et dans le noyau. En conditions adhésives, une relocalisation vers le compartiment cytosol/membrane de la PP2A et de la GSK3β nucléaires est corrélée avec une diminution de la phophorylation de GSK3β sur sa sérine 9, permettant ainsi son activation. Une approche de siRNA et d’inhibiteurs pharmacologiques a permis de montrer que l’intégrine α5, PP2A et GSK3β contrôlaient environ 30 % de la survie des cellules leucémiques en adhésion. Il est intéressant de noter que ce pourcentage de survie est identique à celui que nous avons observé lors de nos expériences de résistance à la daunorubicine liée à l’adhésion cellulaire (CAM- DR), impliquant l’intégrine α5β1 et GSK3β (De Toni F. et al., 2006). Ces données suggèrent fortement que l’action pro-survie de GSK3β a lieu dans un compartiment cytoplasme/membrane, structuré par l’intégrine α5. Dans ce compartiment, GSK3β pourrait être impliquée dans l’inhibition des voies apoptotiques extrinsèque (induite par les récepteurs de mort) ou intrinsèque (induite par les acteurs mitochondriaux) (Beurel E. & Jope R.S., 2006).

La voie de signalisation en aval de l’intégrine α5 reste à approfondir, notamment via la réalisation de co-immunoprécipitations, afin de déterminer si GSK3β interagit dans un complexe comprenant PP2A et l’intégrine α5. La partie C-terminale de la sous-unité β1 des intégrines joue un rôle crucial dans la survie cellulaire liée à la phosphatase PP2A (Pankov R.

et al., 2005) et dans l’inhibition de prolifération (Meredith J.E. Jr et al., 1999). Or, la voie

PP2A/ERK a aussi été impliquée, en aval de l’intégrine α2β1, dans la résistance à l’apoptose induite par Fas (Chetoui N. et al., 2006). De même, la voie ERK est responsable de la résistance à l’apoptose induite par la privation sérique de cellules adhérentes sur fibronectine (Gu J. et al., 2002), et GSK3β est décrite comme régulateur de cette voie (Kim J.W. et al., 2003). Cependant, dans nos expériences, l’inhibition de la kinase ERK ne module pas la survie des cellules leucémiques U937 en adhésion, après stress sérique (Ysebaert L. et al., résultat non publié). En fait, il se pourrait que le rôle de PP2A soit de prévenir l’activation pro-apoptotique de p38, en réponse aux cytokines (Prickett T.D. et Brautigan D.L., 2007). Mais, il reste à déterminer si GSK3β pourrait être impliquée dans cette régulation. Enfin, l’action inhibitrice de GSK3β sur les facteurs pro-apoptotiques mitochondriaux pourrait passer par une régulation du VDAC (voltage dependent anion channel), puisqu’il a été déterminé que GSK3β phosphoryle VDAC sous certaines conditions (Pastorino J.G. et al., 2005).

L’intégrine α4 contrôle le niveau d’expression de GSK3β dans les cellules U937. De plus, elle favorise la phosphorylation activatrice de l’enzyme sur la tyrosine 216, lorsque les cellules sont en suspension ou en adhésion. Cependant, une approche par siRNA nous a permis de montrer que cette intégrine est beaucoup moins essentielle pour réponse au stress immédiate des cellules leucémiques adhérentes, que l’intégrine α5β1. Cependant, nos expériences montrent une corrélation entre l’enrichissement nucléaire de la forme phosphorylée sur tyrosine 216 de GSK3β et des conditions propices à la survie des cellules leucémiques, c’est-à-dire en adhésion. Dans ces conditions, une forte co-localisation entre la tyrosine kinase Pyk2 et GSK3 phosphorylée sur tyrosine a été constatée au niveau nucléaire. Or, Pyk2 est localisée de façon prépondérante dans le noyau des cellules U937 aussi bien en suspension qu’en adhésion, dans nos conditions expérimentales. En accord avec les résultats obtenus par Faure et al., dans un autre modèle cellulaire (Faure C. et al., 2007), nous montrons une dissociation entre la forte phosphorylation sur la tyrosine 402 de Pyk2 observée dans les cellules U937 adhérentes sur fibronectine, signe de son activation et dépendante de l’intégrine α4β1, et cette localisation nucléaire. Par contre, Pyk2 sous forme active régule la phosphorylation activatrice sur tyrosine 216 de GSK3β, dans les conditions basales de culture des cellules U937. Ainsi, dans notre modèle, l’engagement de l’intégrine α4β1 pourrait contrôler la tyrosine phosphorylation de GSK3β par le biais d’une régulation de Pyk2 dan sles cellules leucémiques en suspension ou en adhésion. La spécificité de l’adhésion résulterait donc de la forte activation de Pyk2 et de sa forte co-localisation avec GSK3β dans le noyau. Il reste à savoir si la tyrosine phosphorylation de GSK3β survient dans le cytosol ou après sa translocation nucléaire. La tyrosine phosphorylation de GSK3β pourrait tout aussi bien réguler à proximité la NLS de GSK3β (Meares G.P. & Jope R.S., 2007), ou la dégradation de l’enzyme par le protéasome nucléaire (Ougolkov A.V. et al., 2006). Dans ce contexte, il est intéressant de souligner le rôle de RhoB dans l’accumulation nucléaire de GSK3β (Huang M.

et al., 2006).

Pyk2 a déjà été impliquée en aval de src, dans un modèle de résistance à l’anoïkis, indépendamment des voies PI-3K/Akt ou ERK (Wei L. et al., 2004). Le rôle de Pyk2 dans la survie cellulaire peut impliquer des voies de signalisation spécifique, mais aussi une régulation du cytosquelette via les microtubules (Gil-Henn H. et al., 2007), ou encore une régulation des centres promoteurs (Schindler E.M. et al., 2007). Il serait donc intéressant de rechercher les partenaires de Pyk2 et de GSK3β, dans le noyau des cellules U937 résistantes. Un candidat potentiel, dont nous avons démontré la relevance antérieurement, est le facteur de

transcription NF-κB (De Toni F. et al., 2006). Ainsi, la transcription de gènes anti- apoptotiques, soit par régulation épigénétique, soit par la régulation des co-facteurs des facteurs de transcription, pourrait, sous le contrôle de Pyk2 et de GSK3β, permettre une survie des cellules leucémiques stressées sur le long terme. Actuellement, notre équipe explore ces possibilités.

Nos résultats et les données bibliographiques nous laissent à penser qu’il existeraient

deux « pools » distincts de GSK3β dans les cellules de LAM adhérentes, impliqués tous

deux dans la survie de ces cellules et sous deux formes actives différentes:

• une forme phosphorylée sur tyrosine 216, dans le noyau, qui activerait directement NF-κB, et donc entraînerait la transcription de gènes anti-apoptotiques et de résistance,

• une forme déphosphorylée sur sérine 9, au niveau du compartiment cytoplasme/membrane, qui pourrait jouer un rôle dans l’inhibition des voies apoptotiques extrinsèque et intrinsèque.

Chacune de ces voies de survie serait respectivement sous le contrôle des intégrines α4β1 et α5β1, mais une prédominance fonctionnelle pro-survie serait attribuable à α5β1, au moins sur le court terme. Ceci est en accord avec l’importance attribuée à la forme cytosolique de GSK3β dans les fonctions de survie cellulaire (Meares G.P. & Jope R.S., 2007). Nos données suggèrent une action synergique des deux intégrines dans le contrôle de la survie cellulaire des cellules leucémiques (figure 46). On peut également penser que cette coopération entre intégrines puisse influencer la transformation tumorale, en réponse à un microenvironnement stressant.

L’activation de GSK3β représente donc une nouvelle voie de survie en aval de l’engagement des intégrines. Nous montrons de plus que les intégrines peuvent réguler différentiellement cette enzyme. Cette voie de signalisation, retrouvée active dans certains cancers, pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique, d’où l’importance de bien caractériser ses partenaires de signalisation. Enfin, il reste à déterminer si cette voie de survie est spécifique des cellules tumorales en situation de stress, ou si elle peut être présente dans les cellules normales. Ceci permettrait de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques capables d’éliminer les cellules leucémiques chimiorésistantes, tout en épargnant les CSH normales.

Figure 46 : Schéma hypothétique des régulations différentielles de GSK3β par les intégrines α4β1 et α5β1 dans les cellules leucémiques en réponse à un stress microenvironnemental.

CONCLUSION GENERALE

ET

Conclusion générale et perspectives

Pour finaliser et valoriser nos travaux, il est nécessaire de déterminer si cette voie de survie dépendante de GSK3β n’est retrouvée qu’après transformation leucémique des CSH, et pas à l’état normal des CSH. Or, quelques données suggèrent que cette voie n’est pas essentielle à la résistance de progéniteurs hématopoïétiques normaux. Ainsi, des résultats de l’équipe indiquent qu’un traitement avec des extraits de plantes à fort pouvoir anti-oxydant et anti-inflammatoire entraînent une diminution de l’activité de GSK3β et tuent dramatiquement les cellules de patients atteints de LAM et des lignées leucémiques humaines, alors qu’aucun effet en terme de mort cellulaire n’est observé dans les cellules humaines normales CD34+ (Bouregaa E. et al., en préparation). De plus, un article de l’équipe de Bhatia montre, dans un modèle murin, que l’inhibition de GSK3 augmente in vivo les capacités de repopulation des CSH humaines et murines (Trowbridge J.J. et al., 2006). Ces résultats laissent à penser que l’inhibition de GSK3β permettrait de favoriser le maintien du pool de CSH au détriment des CSL, chez les patients atteints de LAM. Ainsi, un essai clinique avec un inhibiteur de GSK3, à visée anti-leucémique, est en cours aux Etats-Unis. Notre équipe compte également vérifier l’intérêt de cette approche d’inhibition de GSK3β sur un modèle de LAM humaine transplantée chez des souris NOD/SCID, à partir d’échantillons cellulaires de patients atteints de LAM.

A l’heure actuelle, peu de cibles thérapeutiques ont été proposées pour éradiquer spécifiquement les CSL. Seule la suractivation de NF-κB dans les cellules immatures leucémiques (Guzman M.L. et al., 2001) permet de suggérer l’utilisation d’un analogue du parthénolide, le DMAPT, induisant une mort rapide des CSL de leucémies myéloïdes et lymphoïdes, tout en épargnant les cellules hématopoïétiques normales (Guzman M.L. et al., 2007). L’activité du DAMPT favorise des réponses de stress oxydant, l’activation de p53 et l’inhibition du facteur de transcription NF-κB.

Dans notre étude, nous avons montré que la voie de résistance au stress dépendante de l’activation de GSK3β impliquait plusieurs partenaires de signalisation, des intégrines jusqu’au facteur de transcription NF-κB. Dans le rôle majeur que joue GSK3β vis-à-vis de la résistance aux voies de mort d’origine extracellulaire (TNFα et récepteurs de mort), le travail de Chen et al. est tout à fait intéressant à noter. En effet, une simple modulation de la matrice extracellulaire, par la liaison de la protéine matricielle CNN1 aux intégrines αVβ5 et α6β1,

permet la génération de ROS, l’activation de JNK, et restaure la sensibilité à l’action pro- apoptotique du TNFα (Chen C.C. et al., 2007). De plus, les nombreux travaux de l’équipe de Bissell démontrent que le ciblage des intégrines β1 est une stratégie tout à fait intéressante en cancérologie. Ainsi, l’inhibition de l’intégrine β1 entraîne une polarité différentielle des cellules cancéreuses de sein par rapport aux cellules normales en structure 3D, permettant la résistance des cellules normales mais l’induction de l’apoptose des cellules malignes (Park C.C. et al., 2006). Egalement, un traitement ciblant le récepteur d’adhésion CD44 pourrait représenter une stratégie intéressante. En effet, l’activation du CD44 par un anticorps spécifique permet, dans un modèle murin, de délocaliser les CSL de la niche médullaire protectrice, d’induire leur différenciation, et donc leur éradication (Jin L. et al., 2006). Une autre approche consisterait à cibler les CSL qui surexpriment les intégrines α4β1 et α5β1, via l’utilisation du peptide chimérique, RetronectinTM _{(Takara), qui couplé avec un inhibiteur de}

la voie GSK3β, pourrait spécifiquement éradiquer les CSL.

Concernant les partenaires directs de signalisation des intégrines, l’inhibition de la