Les TSG sont caractérisées par la présence d’anomalies moléculaires dans deux gènes cibles : Kit et PDGFRA. Ces anomalies moléculaires jouent un rôle fondamental dans l’initiation tumorale et l’induction du processus de tumorigenèse (7).
La famille des récepteurs tyrosine kinase (RTK), dont les gènes Kit et PDGRFA font partie, est constituée en majeure partie de récepteurs de facteur de croissance dont beaucoup, tels RET, ALK, HER2 et EGFR, peuvent avoir
une activité oncogénique. Le caractère oncogénique de C-Kit muté a été
démontré dans certaines leucémies aiguës, les séminomes, les mastocytoses et les GIST.
Le gène le plus étudié, exprimé par ces TSG, est le C-Kit : CD117, codant pour un récepteur de la tyrosine kinase. Hirota et al. a montré en 1998, que l’hyper expression de la protéine Kit dans les tumeurs stromales gastriques était liée à la survenue d’une mutation activatrice, dite « gain de fonction », au niveau
du gène C-Kit dans environ 85 % des cas, et qu’il s’agissait d’un événement
précoce et probablement causal (29).
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Une fois activée, la protéine Kit devient incontrôlable et autonome. Elle transmet à l'intérieur de la cellule cancéreuse toute une série d'informations qui permettront à cette dernière, devenue incapable de freiner sa division, non seulement de se multiplier et de grossir pour former la TSG, mais également de se propager dans l'organisme pour éventuellement former de nouvelles tumeurs : des métastases.
Au niveau du tube digestif, cette expression de C-Kit est par ailleurs une caractéristique des cellules de Cajal. Cette similitude a d’ailleurs conduit à l’hypothèse selon laquelle les GIST dériveraient des progéniteurs indifférenciés de ces cellules (30).
Application d’anti-corps sur des échantillons de tissus tumoraux (Analyse immuno-histochimique) :
Le premier problème pratique est le choix de l’anticorps. Plusieurs anticorps dirigés contre la protéine Kit sont en effet actuellement
commercialisés, mais les études comparatives permettant d’évaluer
objectivement leur sensibilité et leur spécificité sont rares (20). Les deux anticorps les plus fréquemment utilisés sont l’anticorps polyclonal A4502 (Dako, Glostrup, Danemark) et l’anticorps monoclonal SC168 ou C-19 (Santa Cruz, Santa Cruz, USA) (29).
Beaucoup de variations dans les spectres de marquage de ces différents anticorps ont été observées. Plus qu’à des différences réelles de spécificité ou de sensibilité des anticorps, ces différences sont, sans doute, largement secondaires à des différences dans les techniques d’immunodétection utilisées, incluant l’utilisation de dilutions différentes, et l’emploi ou non de techniques de restauration antigénique.
Le recours, ou non, à une technique de démasquage antigénique est le second problème technique majeur posé par l’immunodétection de Kit. Plusieurs auteurs ont fortement contesté cette pratique, comme susceptible d’être responsable de faux positifs si la dilution de l’anticorps primaire n’est pas adaptée.
Le consensus international (2002) n’a pas donné de recommandation précise sur ce point technique (22). Le consensus de l’ESMO a recommandé de ne pas utiliser de technique de restauration antigénique (31).
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Le consensus francophone pour la prise en charge des GIST a adopté une position plus précise. Conformément aux données de la seule étude comparative actuellement disponible (20), il propose d’utiliser l’anticorps A4502 (Dako), soit à la dilution de 1/300 après restauration antigénique (en l’occurrence, en tampon citrate pH6), soit à la dilution de 1/50 sans restauration antigénique.
La standardisation de l’immunodétection de KIT reste toujours un point crucial et polémique (32, 33). Les variations inter-laboratoires dépendent autant des conditions préanalytiques (comme la fixation et la technique histologique) que de la technique immunohistochimique elle-même (incluant la technique éventuelle de restauration antigénique, le choix de l’anticorps et la technique de révélation).
Il faut insister sur le fait que les anticorps disponibles ne permettent pas de distinguer, sur coupe tissulaire, entre la forme quiescente et la forme active phosphorylée de la protéine. Seules des techniques plus sophistiquées d’immuno empreinte (Western blot) peuvent permettre de répondre à cette question, dans le cadre de protocoles expérimentaux (34).
Avant toute analyse de l’immuno marquage, le premier point à vérifier est
la positivité des contrôles internes. Les plus utilisés sont les mastocytes, toujours présents dans le tissu péri tumoral, notamment dans le chorion de la muqueuse digestive, et souvent présents au sein de la tumeur elle-même. En raison de leur distribution, les mastocytes peuvent servir de contrôles internes dans tous les types de prélèvements, y compris les biopsies endoscopiques.
Un deuxième contrôle interne, utilisable uniquement sur pièce de résection chirurgicale, est constitué par les cellules de Cajal, localisées autour du plexus myentérique.
L’interprétation de l’immuno marquage peut présenter des difficultés liées à trois facteurs principaux :
1)-La localisation cellulaire du marquage pour la protéine KIT
dans les GIST est typiquement cytoplasmique, avec un renforcement membranaire habituellement bien marqué. Un second type de marquage est possible, c’est un marquage cytoplasmique en grains périnucléaires, de type golgien (aspect en dots). Ce marquage en grains peut être isolé ou associé avec un marquage cytoplasmique diffus. Les deux types de marquage peuvent s’associer dans la même tumeur.
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2)-L’intensité du marquage pour KIT dans les GIST est variable, le plus souvent, intense et homogène. L’intensité est faible dans certains cas de GIST morphologiquement typiques, sans qu’aucune signification particulière, notamment pronostique, puisse en être tirée (35).
3)-Le pourcentage de cellules tumorales KIT positives est également variable. La plupart des GIST présente une positivité diffuse et homogène de la totalité ou de la quasi-totalité des cellules tumorales. Dans certains cas, seule une minorité de cellules tumorales, de 10 à 20 %, sont KIT positives. Il n’y a pas d’indication claire sur la limite inférieure du pourcentage de cellules positives, nécessaire pour retenir le diagnostic de GIST, et de quelle façon ces cellules doivent être positives pour que le résultat soit significatif. Cependant, il faut faire particulièrement attention à l’interprétation d’une positivité très focale (moins de 10 % des cellules tumorales), restreinte à de rares cellules isolées ou à des groupes de cellules dispersés. Il convient de les différencier des mastocytes et des cellules interstitielles de Cajal qui servent de témoins internes.
Un score semi quantitatif a été proposé pour prendre en compte ces différents aspects (localisation, intensité, pourcentage de cellules marquées) et faciliter le diagnostic de GIST dans des cas limites (36). Ce score peut servir de guide pour l’interprétation d’un cas difficile mais n’est pas utilisé en pratique courante.
Deux réactions peuvent être observées :
Dans 95% des cas, les anti-corps se fixent sur leur cible : Les tissus tumoraux se colorent en brun. La protéine "KIT" est exprimée. On dit alors que le patient est « KIT positif » et le diagnostic de TSG est confirmé.
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Figure 9 : Image montrant la fixation d’anticorps par les tissus Kit positifs vue au microscope (29)
Dans 5% des cas, les anti-corps ne se fixent pas .Les tissus tumoraux ne
se colorent pas : la protéine « KIT » n'est pas exprimée, on dit alors que le patient est « KIT négatif ». A ce stade, le diagnostic de TSG n'est pas confirmé.
46 Biologie moléculaire :
La recherche de mutations du gène Kit fait appel à des techniques très pointues, relevant de la biologie moléculaire, qui ne peuvent être pratiquées, à l’heure actuelle, que dans un très petit nombre de laboratoires spécialisés. La méthode consiste à prélever des échantillons d’ADN à partir des tissus tumoraux, puis de les analyser afin de décrypter les informations génétiques de la cellule, et d’identifier la mutation se trouvant à l’origine de ces dysfonctionnements.
Toutefois, la nature de cette mutation diffère d'un patient à l'autre, car elle peut survenir à différents niveaux du gène.
Les TSG résultent généralement de la modification, spontanée et incontrôlée, de certaines informations génétiques contenues dans des portions du gène Kit, appelées « exons ». C'est précisément la perte ou la modification d'informations sur l'un des exons, qui va déclencher l'activation de la protéine Kit et aboutir à la formation de tumeurs TSG.
Les mutations de Kit sont retrouvées dans plus de 85% des GIST, les plus fréquentes sont situées au niveau de l’exon 11 (66% des GIST). Ces tumeurs peuvent siéger au niveau de l’estomac ou du grêle (37).
Les mutations de l’exon 9 (9,5%) ne sont jamais rencontrées au niveau de l’estomac, mais déterminent des tumeurs au niveau du grêle. Elles sont aussi impliquées dans les rares lésions primitives péritonéales et rétro péritonéales. Notons que les mutations des exons 11 et 9 de Kit sont pratiquement pathognomoniques des GIST ; leur mise en évidence permet donc de confirmer un diagnostic histologique difficile.
Des mutations plus rares peuvent se trouver au niveau des exons 13 et 17.
Figure 1 : Mutations génétiques du C-Kit responsables des TSG
47 Kit muté Kit type Milieu extracellulaire Membrane Milieu intracellulaire
Prolifération cellulaire Noyau Molécules de signalisation
Mutation du gène Kit
Figure 2 : Mutations de la protéine Kit dans les tumeurs stromales gastriques (14)
Le type de mutation initiale a aussi un impact sur la réponse au traitement par les antityrosines kinases (ATK). Les études les plus récentes ont mis en évidence une forte corrélation entre la présence de mutations et la réponse au traitement par l’Imatinib (38, 39). En effet, dans l’étude américaine de Heinrich faite en 2003 (38), moins de 20 % des patients ayant une mutation de l’exon 11 de KIT a connu une progression tumorale sous traitement, alors que cette proportion était supérieure à 80 % chez les patients sans mutation de KIT. Les patients ayant une mutation de l’exon 9 avaient un taux de résistance intermédiaire.
Même si l’expression du CD117 n’est pas absolument spécifique des TSG, le contexte clinique permet d’éliminer aisément les autres tumeurs, dans lesquelles une positivité est possible (mélanomes, autres sarcomes, sarcomes d’Ewing, tumeurs testiculaires, mastocytoses, etc.…).
Dans environ 15% des cas, aucune mutation de C-Kit n’est retrouvée, avec un immuno marquage CD117 faiblement positif ou négatif. Dans la moitié de ces cas, il existe une mutation de PDGFα « platelet-derived facture receptors », située alors le plus souvent au niveau de son exon 18, plus rarement au niveau des exons 12 ou 14. La recherche de cette mutation peut alors être décisive (30). Protéine Kit Protéine Kit mutée K K K K Activation indépendamment duligand
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En effet, la seule indication pour la recherche de mutations du PDGFA concerne les GIST négatifs pour KIT en immuno-histochimie (environ 5 % des cas), ou dont l’histologie est atypique (31). La détection d’une mutation chez ces patients permet de confirmer le diagnostic de GIST. Bien que la présence d’une mutation paraisse prédictive de la réponse à l’Imatinib, sa recherche n’est pas nécessaire avant traitement car quelques patients sans mutations peuvent répondre au traitement (40).
Les tumeurs avec une mutation de PDGFα siégent dans la grande majorité des cas au niveau de l’estomac, exceptionnellement au niveau péritonéal. Les mutations de C-Kit et de PDGFα sont exclusives les unes des autres.
Restent finalement environ 7% de GIST sans mutations de C-Kit ni de PDGFα, dont la pathologie moléculaire est à l’heure actuelle inconnue. Les GIST de l’enfant, ceux de la triade de Carney ou associées à une neurofibromatose ont ce profil moléculaire.
Deux marqueurs nouveaux des GIST ont été récemment proposés : la protéine DOG1 et la protéine kinase C Θ (PKCΘ).
La protéine DOG1, isolée grâce à un travail élégant d’analyse différentielle, est proposée comme un marqueur sensible et spécifique des GIST (41). Ce marqueur paraît avoir un intérêt particulier pour le diagnostic des GIST associées à une mutation du gène PDGFRA, où la protéine KIT est indétectable dans plus de 60 % des cas, alors que DOG1 y semble constamment exprimée. Il est cependant nécessaire de disposer d’études plus approfondies pour évaluer correctement l’intérêt diagnostique de ce nouveau marqueur.
La protéine PKCΘ est une protéine de signalisation intracellulaire impliquée dans la transmission des signaux, induits par l’activation de KIT ou de PDGFRA. Plusieurs travaux récents montrent que cette protéine est surexprimée dans les GIST, y compris dans les tumeurs KIT-négatives et dans les tumeurs associées à des mutations du gène PDGFRA (42, 43, 44).
Il existe donc une corrélation entre le tableau clinique et le type de mutation impliqué dans la survenue des TSG. La relation entre l’évolution naturelle et le type de mutation reste imprécise. Il apparaît toutefois, que les tumeurs avec mutation de PDGFα, ou sans mutation de C-Kit ou PDGFα, pourraient avoir une évolution plus lente, et un moindre risque de dissémination. Il est certain que si les anomalies de Kit ou de PDGFRA sont nécessaires à l’induction du processus de tumorigenèse dans les GIST, elles ne suffisent pas à expliquer la progression tumorale et l’évolution variable de ces tumeurs.
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Plusieurs techniques et plusieurs stratégies ont été utilisées pour tenter d’identifier des marqueurs génétiques de progression tumorale. Les données
disponibles sont encore relativement fragmentaires. Des anomalies
chromosomiques récurrentes ont été décrites aussi bien dans les formes bénignes que dans les formes malignes, notamment en 14q et 22q (45, 46). La comparaison du matériel génomique entre tumeurs bénignes et tumeurs malignes par la technique de CGH (47, 48) a montré que des pertes, notamment en 9p, et des gains de matériel chromosomique étaient fréquents dans les formes
malignes et pourraient avoir une valeur pronostique. Cependant, aucune étude
n’est venue confirmer cette hypothèse.
Enfin, à l’événement mutationnel initial, déterminant la survenue de la maladie, peut se surajouter, au fil de l’évolution tumorale, d’autres événements génétiques, susceptibles de retentir aussi sur l’agressivité de la tumeur et sur sa réponse au traitement (30).
L’étude japonaise de Koyama T. a trouvé que la mutation de la gêne C - Kit avait une incidence de 31% dans les TSG primitives, augmentant jusqu’à 57% pour les TSG métastatiques (49, 76). Elle a précisé également que le développement d’une nouvelle mutation au niveau du gène Kit pouvait être responsable de la rechute tumorale (50, 51).
Jusqu’à présent, le mécanisme de développement d’une seconde mutation du gène Kit n’est pas précisé, mais on sait que cette nouvelle mutation peut être responsable d’une résistance à l’Imatinib après 27 mois en moyenne du début du traitement (50).
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La protéine CD34 :
La protéine CD34 a été l’un des premiers marqueurs diagnostiques ayant contribué à l’émergence du concept de GIST au sein des tumeurs mésenchymateuses digestives (52, 53, 54).
La fonction de la protéine CD34 n’est pas complètement connue ; dans certains types cellulaires, notamment les cellules endothéliales, elle fonctionne comme une protéine d’adhésion et sert de récepteur pour la L-sélectine, exprimée par les leucocytes; il est néanmoins peu probable que cette fonction soit retrouvée dans les cellules mésenchymateuses.
CD34 est exprimée à l’état normal par les cellules souches hématopoïétiques, les cellules endothéliales et certaines sous populations de cellules fibroblastiques. Elle est également exprimée par de très nombreuses tumeurs, notamment mésenchymateuses.
La sensibilité de CD34 pour le diagnostic des TSG est inférieure à celle de KIT (25). Seulement 60 à 70 % des TSG expriment CD34, alors que KIT est exprimée dans 95 % des TSG.