Toutes les expériences pour la caractérisation des activités spécifiques du peptide H3122- 135 sont réalisées dans un flacon de 4 mL fermé par un septum, à 4°C, avec un tampon phosphate 10 mM à pH 7,9, avec un volume final de 1 mL, et en utilisant les solutions suivantes :
- une solution de tampon phosphate 10 mM pH 7,9 à 4°C
- une solution à 4°C re-concentrée de 3H-BPASS (1,4 mM et 720 MBq.mL-1), d’activité spécifique 514 GBq.mmol-1, tamponnée environ à 10 mM de phosphate pH 7,9.
- une solution à 4°C de peptide H3122-135 (2,8 mM) dans l’eau ultra pure.
- une solution à 4°C de protéine hAsf11-156 (560 µM)16 à 10 mM de phosphate pH 7,9. - une solution à 4 °C d’apomyoglobine (560 µM)16 à 10 mM de phosphate pH 7,9.
Lors des déplacements hors du laboratoire, le flacon de 4 mL, contenant la solution radioactive de réaction, est placé dans une jaquette en aluminium étanche refroidie à 4°C et entreposé dans la glace17. La jaquette à 4°C permet de maintenir la température hors de la glace suffisamment longtemps pour réaliser les expériences d’irradiation avec le LINAC.
a. Calcul de la concentration de complexe théorique formé [RL]
La concentration de complexe théorique formée est déterminé avec l’équation suivante :
16 Suivant les lots de purification, les concentrations des solutions mères des deux protéines étaient situées entre 500 µM et 1 mM. Les volumes ajoutés à la solution de réaction sont ajustés en conséquence.
avec [RL] qui est la concentration de partenaire lié (µM) ; R0 et L0 qui sont les concentrations initiales du récepteur et de ligand (µM) ; et Kd qui est la constante de dissociation (40 µM).
Pour nos expériences sur le peptide H3122-135, la concentration théorique [RL] est fixée à 113 µM soit environ 80 % de peptides H3122-135 liés, avec R0 = 140 µM (H3), L0 = 280 µM (Asf1) et Kd = 40 µM.
Pour les expériences sur la protéine hAsf11-156, la concentration théorique [RL] est fixée à 170 µM soit environ 85 % de protéines hAsf11-156 liées, avec R0 = 200 µM (Asf1), L0 = 400 µM (H3) et Kd = 40 µM.
b. Protocole de mise au point (nombre de HO• et équivalent en 3H-BPASS) • Effets du nombre d’impulsions sur l’incorporation de tritium
Une solution est réalisée en ajoutant 850 µ L de tampon phosphate 10 mM pH 7,9 et 100 µ L de solution de 3H-BPASS (140 µM finale) et la solution résultante est dégazée en bullant avec N2O pendant 30 min. L’aiguille est retirée de la solution, et sous un flux de N2O, 50 µL de solution de H3122-135 (140 µM finale) sont ajoutées. Le mélange réactionnel est irradié à température ambiante avec le LINAC avec 25, 50, 100 ou 250 impulsions de 20 Gy à 0,4 Hz, soit respectivement une concentration de 291 (2,1 éq.), 582 (4,2 éq.), 1165 (8,3 éq.) et 2912 µM (21,0 éq.) cumulée en HO•. Les échantillons sont purifiés sur SepPack light C18 et subissent un traitement acide selon le même protocole décrit précédemment, puis purifiés par HPLC sur phase inverse C18, puis séquencés selon le protocole des parties IV.J.1.c et IV.H.
Ce protocole correspond à la Figure III-16.
• Effet du nombre d’équivalents en 3H-BPASS et de la présence de hAsf11-156
Dans la glace, une solution est réalisée en ajoutant 350 ou 50 µL de tampon phosphate 10 mM pH 7,9 et 100 ou 400 µL de solution de 3H-BPASS (140 µM ou 560 µM final respectivement). 50 µ L de solution de H3122-135 (140 µM finale) et 500 µ L de hAsf11-156 (280 µM finale) sont ensuite ajoutés. La solution résultante est dégazée avec N2O pendant 5 min
[RL] =
2
Kd + R0 + L0 -√ (Kd + R0 + L0)2 – 4 R0L0)
sans buller. Le flux est coupé, et la solution est agitée doucement puis laissée à équilibrer en échangeant l’O2 dissous avec les molécules de N2O pendant 10 min. Le flux de N2O est rallumé pendant 2 min, puis recoupé. La solution est agitée doucement puis laissé équilibrer de nouveau pendant 10 min. Cette opération est réalisée 4 fois au total. Le mélange réactionnel est irradié à 4°C avec le LINAC avec 100 impulsions de 20 Gy à 0,4 Hz, soit une concentration cumulée de 1165 µM en HO•.
L’échantillon est ensuite traité sur une colonne SepPack light tC2 (Waters) pour séparer le peptide de la protéine et pour éliminer 3H-BPASS. Après 5 lavages à l’eau, 500 µ L d’un éluant à 20 %, puis 30 %, puis 70 % en ACN / TFA 0,1 % sont passés. Les fractions (20 et 30 % ACN / TFA 0,1 %) contenant le peptide sont regroupées, traitées à l’acide, et le peptide est purifié en HPLC sur phase inverse C18, puis séquencé (voir protocole dans les parties IV.H et IV.J.1.c).
Ce protocole correspond à la Figure III-17.
c. Protocole d’incorporation en atomes de tritium du peptide H3122-135
Dans la glace, une solution est réalisée en ajoutant 350 µ L de tampon phosphate 10 mM pH 7,9, 100 µL de solution d’3H-BPASS (140 µM final) et 50 µL de solution de H3122-135 (140 µM final), avec ou sans ajout de 500 µ L d’hAsf11-156 ou d’apomyoglobine (280 µM final). La solution résultante est dégazée avec N2O pendant 5 min sans buller. Le flux est coupé, et la solution est agitée doucement puis laissée à équilibrer en échangeant l’O2 dissous avec les molécules de N2O pendant 10 min. Le flux de N2O est rallumé pendant 2 min, puis recoupé. La solution est agitée doucement puis laissée à équilibrer de nouveau pendant 10 min. Cette opération est réalisée 4 fois au total. Le mélange réactionnel est irradié à 4°C avec le LINAC avec 100 impulsions de 20 Gy à 0,4 Hz, soit une concentration de 1165 µM cumulée en HO•.
Le peptide seul est traité sur SepPack light C18 et traité à l’acide comme précédemment. Les échantillons contenant la protéine sont traités sur une colonne SepPack light tC2 (Waters) pour séparer le peptide de la protéine et pour éliminer 3H-BPASS. Après 5 lavages à l’eau, 500 µ L d’un éluant à 20 %, puis 30 %, puis 70 % en ACN / TFA 0,1 % sont passés. H3122-135 issu des échantillons contenant l’apomyoglobine, mal séparé sur SepPack light tC2, est purifié avant traitement acide par HPLC sur une colonne semi-préparative (Agilent C18 5
µ, 300 Å, 450 mm*10 mm) en isocratique H2O/ACN/TFA 90/10/0,1 pendant 20 min (tR H3 = 12 min). Les fractions (20 et 30 % ACN / TFA 0,1 %) contenant le peptide sont regroupées, traitées à l’acide, lyophilisées et reprises dans 100 µ L d’eau ultrapure.
• Purification de H3122-135 irradié avec le LINAC
Le peptide est purifié par HPLC avec une colonne analytique (Agilent Zorbax C18, 300 Å, 250*4.6 mm) selon le gradient 2 à 20 % B en 40 min à 1 mL.min-1 (tR H3 = 23 min) avec les éluants (A : H2O / FA 0,1 % ; B : ACN / FA 0,1 %), avec une détection UV à 216 nm. Les puretés UV et radiochimique sont contrôlées selon le même gradient.
Le peptide purifié est contrôlé par HPLC puis séquencé selon le protocole général (IV.H).