a. Expression de la protéine hAsf1-156
Le vecteur d’expression pETM30 est choisi. C’est un plasmide qui permet, chez la bactérie E. coli DE3, l’expression d’une protéine de fusion GST étiquetée 6 histidines à son extrémité N-terminale. Le vecteur d’expression contenant le gène codant pour la protéine de fusion hAsf11-156 a été fourni par F. Ochsenbein du CEA Saclay.
La surexpression de la protéine recombinante dans des bactéries E. coli Bl21 Gold DE3 à 20°C est induite par l’ajout d’IPTG dans le milieu LB. Après une nuit d’induction, les bactéries sont récoltées par centrifugation (5000 rpm pendant 15 minutes à 4°C), puis resuspendues dans un tampon favorisant la lyse des bactéries (tampon Tris 50 mM pH 8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, Glycérol 5 % (v/v), Triton 100X 1 % (v/v), PMSF 1 mM, DTT 1 mM, aprotinine 6 µg.mL-1). Les parois de bactéries Bl21 gold DE3 sont fragilisées par congélation-décongélation puis par l’incubation avec du lysozyme (Sigma) à 0,5 mg.mL-1 pendant une heure à 4°C. L’ADN est détruit par émission d’ultrasons dans le milieu. Les bactéries lysées sont centrifugées à 10000 rpm pendant 30 minutes à 4°C afin de séparer les
débris cellulaires et les corps d’inclusion de tous les composants solubles. La présence de la protéine recombinante dans la fraction soluble est vérifiée par SDS-PAGE.
b. Purification de la protéine hAsf11-156
La purification comporte trois étapes, deux chromatographies d’affinité, une colonne de GSH-agarose suivie d’une Ni-NTA, et enfin une chromatographie échangeuse d’ions. Ces trois étapes sont détaillées dans ce qui suit.
i.
Purification GSH-agarose
La fraction soluble, préalablement filtrée sur filtre 0,22 µm, est chargée sur une colonne de billes d’agarose couplées au glutathion réduit. Ces billes sont préalablement réhydratées et équilibrées avec le tampon de lyse des bactéries. 1 mL de billes peuvent fixer environ 10 mg de protéine de fusion ; pour un litre de culture il faut compter environ 10 mL de billes. Ces billes sont lavées avec 5 volumes de tampon Tris 50 mM pH 8, NaCl 1M, puis équilibrées avec 5 volumes de tampon phosphate 50 mM pH 8. Enfin, la protéine est éluée avec du tampon phosphate 50 mM pH 8 contenant 10 mM glutathion réduit (Figure IV-1).
Figure IV-1 SDS-PAGE de la purification par chromatographie d’affinité GSH-agarose de GST- hAsf11-156. puits 1, marqueurs de poids moléculaires ; 2, surnageant avant passage sur colonne ; 3,
surnageant après passage sur colonne; 4, lavage NaCl 1M ; 5, billes avant élution ; 6, 7 et 8 élutions de 10 mL de GSH ; 9, billes après élution .
La quantité de protéine de fusion éluée est déterminée par Bradford et par gel SDS- PAGE. Les protéines sont révélées sur le gel par coloration dans une solution de bleu de Coomassie : 40 % éthanol, 10 % acide acétique, 400 mg.L-1 de bleu de Coomassie (Sigma). Le gel est représenté sur la Figure IV-1.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
45 GST-hAsf11-156
31,5
21 66
ii.
Purification de la protéase Tev et coupure de la protéine recombinante
Un vecteur d’expression contenant le gène codant pour la protéase du virus Tev étiquetée six histidines est utilisée pour transformer des bactéries E. coli Bl21 Gold DE3 pLysS (fourni par F. Ochsenbein du CEA Saclay). Après induction de l’expression de la protéine recombinante, les cellules sont cassées et centrifugées afin de récupérer le surnageant. La protéine recombinante est purifiée sur colonne Ni-NTA. Trois lavages à des concentrations en imidazole de 9, 30 et 80 mM sont effectués. La protéine est éluée à 300 mM d’imidazole. L’imidazole est très rapidement éliminé par ultracentrifugation et la protéine est resuspendue dans un tampon contenant 50 % de glycérol. Elle est alors congelée à -80°C. La quantité de protéase purifiée est estimée par Bradford.
La protéine de fusion GST-hAsf11-156 est clivée par la protéase du virus TEV étiquetée (His)6 dans un rapport de 1% (w/w) de protéase/protéine de fusion pendant 16 heures à température ambiante. La qualité du clivage est contrôlée par SDS-PAGE.
iii.
Purification Ni-NTA
L’éluât ainsi traité est complété à moitié avec du tampon Tris 50 mM pH8, Imidazole 10 mM, PMSF 5mM et incubé pendant une heure à 4°C sur roue avec des billes Ni-NTA agarose (Qiagen) elles-mêmes équilibrées avec ce tampon. Les billes sont coulées dans une colonne de 20 mL et la première fraction est directement collectée ainsi que 2 autres après ajout du même tampon. Les fractions sont déposées sur gel SDS-PAGE afin de déterminer la quantité de protéine dans chacune d’entre-elles (Figure IV-2).
iv.
Chromatographie échangeuses d’anions
La purification est réalisée sur le système HPLC Akta d’Amersham Pharmacia Biotech comportant différents modules synchronisés entre eux et automatisés, avec en série un collecteur de fractions. Les procédures sont programmées via le logiciel UNICORN (version 4.11). Après filtration sur filtre 0,22 µm, la protéine est injectée par une boucle de 150 mL sur une colonne échangeuse d’anions Resource Q (Amersham). Après une étape d’élimination (avec 0 % de B) des protéines interagissant avec la colonne de manière non spécifique, en faisant passer du tampon Tris 50 mM pH 8 contenant 50 mM NaCl, la protéine est séparée des autres en appliquant un gradient de sel non linéaire de 0 à 20 % de B en 10 min, 20 à 40 % B en 40 min, avec un débit de 2 mL.min-1 (A : Tp Tris 50 mM pH 8 ; B : Tp Tris 50 mM pH 8 / NaCl 1N). La protéine hAsf11-156 sort à 22 % de B.
La pureté de la protéine est contrôlée sur gel SDS-PAGE (Figure IV-2).
Figure IV-2 SDS-PAGE contrôle de la purification sur colonne NiNTA et de la chromatographie HPLC échangeuse d’anion de la protéine hAsf11-156. puits 1, hAsf11-156 purifiée sur colonne échangeuse d’anion ; 3
et 4, hAsf11-156 purifiée de la colonne NiNTA ; 5, marqueurs de poids moléculaires.
v.
Concentration de l’échantillon
La solution de protéine est concentrée en réalisant un changement de tampon avec du tampon phosphate 10 mM pH 7,9 par ultrafiltration sur cellule AMICON (Millipore) avec une membrane YM10 (« cut-off » de 10 kDa) de 45 mm de Ø puis 25 mm. La solution concentrée entre 500 µM et 1 mM est estimée par mesure de l’absorbance à 280 nm (ε280 nm = 20340 M-1.cm-1). La concentration exacte est obtenue par une analyse de la composition en acide aminé et de la concentration protéique en réalisant une hydrolyse acide HCl 6N.