Isolement et identification des métabolites spécialisés

Préparation d’un concentré en métabolites polyphénoliques d’intérêts

Avant de fractionner l’extrait méthanol par chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC), il est préférable de concentrer l’extrait en métabolites d’intérêts, qui sont les tannins, flavonoïdes, acides phénoliques et phénylpropanoïdes dans ce cas-ci. La macération par gradient de polarité a déjà permis de séparer les pigments, terpènes et composés apolaires, mais l’extrait méthanol obtenu contient une quantité importante de sucres simples (monosaccharides, disaccharides, etc.). Ces composés avaient été détectés lors du profilage des métabolites de l’extrait méthanol par HPLC-UV-ELSD. En séparant les sucres simples de l’extrait méthanol, de meilleurs pourcentages de récupération des composés d’intérêts pourront être obtenus lors du fractionnement par MPLC puisque lors de l’injection davantage de polyphénols seront chargés (loading) sur la cartouche.

L’extraction liquide-liquide est une technique appropriée pour séparer des composés polaires solubles dans l’eau des composés moins hydrophiles. Cette technique est couramment utilisée lors du fractionnement d’extraits bruts qui ont été obtenus d’une macération dans un mélange d’éthanol et d’eau. Habituellement, l’extrait brut est suspendu dans l’eau, des extractions liquide-liquide successives avec de l’hexanes, de l’acétate d’éthyle et du butanol sont ensuite effectuées (Figure 35). Les sucres restent ainsi dans la phase aqueuse, les composés apolaires sont éliminés avec l’hexanes alors que les composés d’intérêts sont dans les phases acétate d’éthyle ou n-butanol selon leurs polarités et propriétés physicochimiques. Une autre technique qui permet de préparer des concentrés de polyphénols est le traitement sur résine adsorbante polymérique macroporeuse non-ionique (Figure 36).201,202 _{Ce type de résine polymérique qui est conçu pour retenir les}

composés neutres/aromatiques alors que les sucres et composés hydrophiles non retenus sont élués à l’eau. Pour relarguer les composés d’intérêts, des solvants polaires tels que le méthanol, l’éthanol, l’acétone, l’acétate d’éthyle sont utilisés. Cette technique a d’ailleurs été employé précédemment pour obtenir des concentrés de polyphénols à partir d’échantillons de sirop d’érable et de miel.203,204

Figure 36 Processus de fractionnement/purification sur une résine polymérique

L’extraction liquide-liquide ainsi que le traitement sur résine polymérique pour enlever les sucres simples de l’extrait méthanol ont été testés afin de déterminer quelle approche permet d’obtenir le meilleur rendement tout en ayant une bonne sélectivité. Pour l’extraction liquide-liquide, l’extrait méthanol a été suspendu dans l’eau et a été extrait seulement avec de l’acétate d’éthyle (AcOEt). L’utilisation d’hexanes n’était pas nécessaire comme l’extrait MeOH a été obtenu par macération avec gradient de polarité. L’extraction avec un solvant plus polaire comme le n-butanol, n’a pas été effectuée puisque l’objectif était de seulement retirer les sucres et non de

fractionner les composés d’intérêts dans l’extrait. Lors de l’expérience, 173 mg d’extrait MeOH ont été suspendus par sonication dans 5 mL d’H2O, puis la suspension a été extraite 3 fois avec des portions de 5 mL

d’AcOEt. Pour le traitement sur résine XAD-16, il est préférable que l’extrait soit complètement soluble dans l’eau pour que le chargement et la rétention des composés sur la phase stationnaire soient optimaux. Dans ce cas-ci, l’extrait n’est pas entièrement soluble dans l’eau. La mise en colonne de l’extrait a ainsi été effectuée via une méthode d’adsorption de l’extrait sur une phase stationnaire (drypack). Un drypack à base de celite 545 a donc été préparé en solubilisant 150 mg d’extrait dans le MeOH et en ajoutant 800 mg de celite. Contrairement à la silice, la terre de diatomée ne retient presque pas les composés. Lors du lavage à l’eau, les composés hydrophiles sont ainsi rapidement relargués du drypack, de même que les composés plus apolaires lors de l’élution au MeOH. Après conditionnement de la cartouche de 4 g de résine XAD-16, le drypack a été ajouté sur la résine, puis le lavage à l’eau (2 CV) et l’élution au méthanol (3 CV) ont été effectués. Les pourcentages de récupération et les rendements de la partition et du traitement sur résine XAD-16 sont présentés au Tableau 9 alors que le profilage des extraits et fractions par HPLC-ELSD est présenté à la Figure 37.

Figure 37 Profil HPLC-ELSD de l’extrait MeOH après partition H2O/AcOEt et traitement sur XAD-16

En se basant sur les profils HPLC avec détection par ELSD, l’extraction liquide-liquide ainsi que le traitement sur la résine XAD-16 ont permis d’éliminer les sucres simples de l’extrait tel que démontré par l’absence du pic majoritaire au temps mort de la colonne (3 min). Les phases organiques (MeOH et AcOEt) des deux procédés ont un profil en métabolites spécialisés très similaires. Dans le cas des phases aqueuses résiduelles, outre le

pic correspondant aux sucres tel que les monosaccharides et disaccharides, pratiquement aucun composé d’intérêt n’est présent, ce qui démontre la sélectivité des deux techniques. Si l’on compare les rendements d’extraction obtenus pour les phases organiques, seulement 36 % des métabolites d’intérêts ont été extraits lors de la partition à l’AcOEt alors qu’un rendement d’extraction de 66 % a été obtenu pour le traitement sur résine. En ce qui concerne les pertes d’extrait lors de l’extraction, moins de 1 % a été perdu lors des manipulations. Pour le traitement sur résine, un peu moins de 3 % ont été perdus ce qui peut s’expliquer par l’adsorption des composés sur la résine. En tenant compte de ces résultats, le traitement sur résine polymérique a été préféré à l’extraction liquide-liquide puisqu’une meilleure récupération des composés d’intérêts dans la phase organique a été obtenue. Il aurait été intéressant de traiter sur résine polymérique la phase aqueuse résiduelle issue de l’extraction liquide-liquide pour déterminer la proportion de composés d’intérêts qui sont restés dans la phase aqueuse.

Tableau 9 Rendement de la partition et du traitement sur résine polymérique de l’extrait MeOH

Méthode Masse (mg) Récupération % Perte %

Employée Départ Phase Aq. Phase Org. Phase Org. Total

Partition

H2O/ AcOEt 173 110,1 62,3 36,0 < 1

Résine

XAD 150 45,6 100,2 66,6 2,8

Afin de préparer à plus grande échelle le concentré de polyphénols d’intérêts, 22 g d’extrait méthanol ont été traitement sur résine XAD-16 avec un gradient d’élution (H2O/MeOH) ce qui permet d’effectuer une première

séparation tout en retirant les sucres de l’extrait. Pour ce faire, 22 g d’extrait ont été solubilisés dans le MeOH pour préparer un drypack avec 100 g de celite 545. Ce drypack a ensuite été divisé en 4 échantillons d’environ 30 g qui ont été traités sur une cartouche de 125 g de résine. Les conditions d’élutions et le suivi du fractionnement par HPLC-UV sont présentés à la Figure 38.

Le fractionnement a mené à l’obtention de 7 fractions (XAD1 1-7). Les fractions ont été analysées par HPLC- UV et HPLC-MS pour rassembler les fractions ayant une composition en métabolites similaires et pour confirmer les types de composés présents. Les saccharides qui n’interagissent pas avec la phase stationnaire ont été élués dans la fraction XAD1 1, soit le lavage 100 % aqueux. Les fractions XAD1 2 et 3 (20-30 % MeOH) contiennent majoritairement des ellagitannins alors que les fractions XAD1 6 et XAD1 7 sont composées de flavonoïdes glycosylés qui ont été relargués de la colonne à partir de 60 % méthanol. Dans le cas des fractions XAD1 4 et 5, un mélange complexe d’ellagitannins, de gallotannins, d’acides phénoliques, de

phénylpropanoïdes et de flavonoïdes a été élué de la colonne avec une phase mobile comprise entre 40 et 50 % méthanol.

Figure 38 Fractionnement de l’extrait MeOH sur résine XAD-16 avec gradient d’élution

Purification des flavonoïdes

Les fractions XAD1 6 et 7 ont été fractionnées par HPLC semi-préparative afin d’isoler les flavonoïdes glycosylés (Figure 40 et Annexe 4). Une mise à l’échelle efficace de la HPLC analytique à la HPLC semi-préparative a été réalisée en utilisant la méthodologie de transfert géométrique qui permet de convertir les conditions d’élution optimisées à l’échelle analytique.200 _{La composition en métabolites de chacune des fractions a été déterminée}

par HPLC-UV-ESI-TOF-HRMS. Les 20 fractions mixtes ont été rassemblées en 6 groupes (F0-F5) selon leur profil en métabolites.

Figure 39 Complémentarité des systèmes de solvants pour la purification des flavonoïdes

L’optimisation de la séparation de ces fractions a été réalisée par HPLC-UV en phase inverse (C18) avec deux systèmes de solvants, soit H2O/MeOH ainsi que H2O/ACN. Les chromatogrammes des fractions XAD1 7A, 7D

et 7E qui sont respectivement contenues dans les groupes F0, F2 et F5, sont présentés à la Figure 39 pour les deux systèmes de solvants. Ces analyses ont permis de déterminer que l’interaction des composés avec la phase stationnaire pouvait être modulée en fonction de la composition de la phase mobile. Dans le cas des fractions XAD1 7A (F0), 7D (F2) et 7E (F5), certains métabolites qui n’étaient pas résolus le sont devenus en changeant le méthanol par de l’acétonitrile. L’analyse et l’optimisation du gradient d’élution des 10 fractions mixtes par HPLC-UV avec la phase mobile H2O/ACN a mené au rassemblement des fractions en 5 groupes qui

ont été purifiés par HPLC semi-préparative. Au total, 10 composés purs, 5 composés semi-purs et 15 fractions semi-purifiées ont été obtenus (Figure 40 et Annexe 4). Le profil HPLC des composés purs, des composés semi- purifiés et des fractions semi-purifiées sont présentés à l’Annexe 5. La pureté des composés semi-purifiés est assez élevée, soit de 88-95 %. Dans le cas des fractions semi-purifiées, un mélange de 2 à 5 composés a été détecté par HPLC-UV. En utilisant la stratégie de complémentarité des solvants (H2O/ACN) sur une phase

Figure 40 Méthodologie pour la purification des flavonoïdes par HPLC semi-préparative

Identification des flavonoïdes par spectrométrie de masse et RMN

Chaque fraction qui a été obtenue lors de la purification a été analysée par HPLC-UV-HRMS afin d’identifier leur composition. La spectrométrie de masse est une technique de choix pour tenter d’identifier l’aglycone et l’unité glycosylée. Lors de l’ionisation dans la source selon les paramètres utilisés, le lien carbone-oxygène est facilement clivé ce qui mène à l’ionisation de l’aglycone. En comparant, le ratio masse sur charge (m/z) et le patron isotopique de l’ion aglycone à ceux des flavonoïdes qui ont été précédemment rapportés dans la littérature, il est possible de proposer une structure.205,206 _{Dans le cas de l’unité glycosylé, la différence de m/z}

entre l’ion moléculaire (M-H ou M+H) et l’ion de l’aglycone correspond au ratio m/z du fragment glycosylé (Figure 41). Il est rapporté dans la littérature qu’un ratio m/z de 132, 148, 162 et 176 correspondent respectivement à une unité pentose, rhamnose, hexose et glucuronide.205,206

Figure 41 Fragmentation des flavonoïdes glycosylés ionisés dans la source

Les résultats de l’analyse par HPLC-ESI-TOF-HRMS des composés purifiés et semi-purifiés sont présentés au Tableau 10, alors ceux des fractions semi-purifiées figurent à l’Annexe 6. Lors de l’ionisation en mode positif, l’ion moléculaire (M+H) et l’ion de l’aglycone ont été détectés, le ratio m/z associé à l’unité glycosyle (∆ m/z) a

ainsi pu être calculé. Les analyses ont aussi été effectuées en mode d’ionisation négative pour confirmer le ratio m/z de l’ion moléculaire. Pour tous les composés analysés, l’ion de l’aglycone est de 303 m/z ce qui correspond à la quercétine. Dans le cas du glycosyle, des unités hexose, pentose, glucuronide ont été détectés ainsi qu’un ratio m/z de 190. Cette unité glycosylée pourrait correspondre à l’ester méthylique de la fonction acide du glucuronide quoiqu’elle ne soit pas très fréquemment rapportée dans le domaine des produits naturels.

Tableau 10 Caractérisation des composés purs et semi-purifiés par HPLC-MS et RMN

Composé RT (min) m/z (M+H) m/z (M+H-_Sucre) ∆ m/z RT imp. _(min) Caractérisation RMN

F1A 13,815 465,6990 303,7131 162 1_H, 13_{C, HSQC, COSY, HMBC} F1B 12,941 465,1045 303,0508 162 1_H, 13_{C, HSQC, COSY, HMBC} F1C 14,149 479,0826 303,0501 176 1_{H, HSQC, COSY} F1D 14,507 479,0812 303,0499 176 16,462 1_{H, HSQC, COSY} F1E 18,703 435,0911 303,0494 132 - 1_{H, HSQC, COSY} F2A 13,710 465,1013 303,0491 162 1_H, 13_{C, HSQC, COSY, HMBC} F2B 18,638 435,0906 303,0486 132 1_H, 13_{C, HSQC, COSY, HMBC} F5C 18,677 435,0906 303,0488 132 1_H, 13_{C, HSQC, COSY, HMBC} F5A 18,733 435,0901 303,0487 132 1_H, 13_{C, HSQC, COSY, HMBC} F5B 19,918 435,0901 303,0483 132 1_H, 13_{C, HSQC, COSY, HMBC} F2C 15,075 479,0807 303,0492 176 17,512 1_{H, HSQC, COSY} F5D 19,925 435,0802 303,0486 132 1_H, 13_{C, HSQC, COSY, HMBC} F5E 22,821 493,0952 303,0489 190 1_{H, HSQC, COSY} F5F 13,768 465,1007 303,0489 161 15,1 1_{H, HSQC, COSY} F5G 22,823 493,0951 303,0484 190 19,850 1_{H, HSQC, COSY}

Les flavonoïdes tels que la quercétine portent plusieurs hydroxyles, mais elle est habituellement substituée en positon 3 ou 7’. Pour deux ions moléculaires dont l’aglycone et l’unité glycosylée sont les mêmes, il est donc possible qu’ils soient des isomères de positions. L’unité glycosylée peut aussi avoir différentes configurations (glucose et galactose) ce qui peut expliquer le nombre élevé de composés ayant les mêmes ratios m/z pour l’aglycone et le glycosyle. Lors des analyses des fractions semi-purifiées, plus de 11 hexoses, 7 pentoses, 6 glucuronides, 2 méthyles esters glucuronides liés à une quercétine ont été détectés. Pour certains de ces composés, il se peut qu’ils ne soient pas tous des isomères puisque les différences de temps de rétention ne sont peut-être pas significatives. Les molécules purifiées contenant des teneurs variables en acide formique, ce qui peut mener à la formation d’adduits. Les spectres RMN des composés devront être comparés pour déterminer s’il s’agit bien de composés distincts. Parmi les fractions semi-purifiées, des quercétines liées à un fragment rhamnose de 146 m/z ont aussi été détectées (Tableau 11). Outre la quercétine qui semble être

l’aglycone majoritaire des flavonoïdes du bouleau glanduleux, des m/z de 287 (kaempférol), 291 (catéchine) et 211 (physcion ou fragment 3,5,4’ trihydroxyflavone) ont aussi été détectés.207,208,209,210 _{De plus, des composés}

di glycosylés (611 m/z) correspondant à la rutine pourraient aussi être présents dans l’extrait (Tableau 11). Tableau 11 Analyse des fractions semi-purifiées par HPLC-ESI-TOF-HRMS

Fractions Composé RT (min) MS ESI - TOF (M+H) (M+H- Sucre) ∆ m/z F1F 11,199 611,1655 F1F 11,558 611,1658 F1L 15,915 355,1740 F4A 18,747 449,1070 287,0547 162 F3C 20 440,2481 291,1797 149 F4B 20,751 449,1066 287,0543 162 F4A 20,754 449,1069 303,0497 146 F4B 21,137 449,1064 303,0491 146 F4A 21,146 449,1069 303,0497 146 F3C 21,572 395,2031 211,1683 184 F3C 22,019 373,2208 211,1683 162

Les composés purifiés et semi-purifiés ont été analysés par RMN pour confirmer l’identification putative par spectrométrie de masse (Tableau 10). Pour les composés purs, une analyse complète (1_H, 13_{C-DEPTQ, HSQC,}

COSY, HMBC) a été effectuée. Parmi les 10 composés purs, il a été identifié que les feuilles contiennent la quercétine-3-O-α-L-arabinopyranoside, la quercétine-3-O-α-L-arabinofuranoside, la quercétine-3-O-β- galactopyranoside, la quercétine-3-O-β-glucuronopyranoside et la quercétine-3-O-(6-O-méthyle)-β-D- glucuronopyranoside (Figure 42). La spectroscopie RMN est la technique de choix pour confirmer la structure des composés, ces derniers doivent toutefois avoir une pureté ≥ à 85 % pour déterminer leur configuration absolue. Lorsque des fractions semi-purifiées sont analysées par RMN, il est possible de déterminer le type de structure et le nombre de composés présents dans le mélange. Pour les flavonoïdes, l’analyse des spectres RMN 1_{H et HSQC permet de confirmer la structure de l’aglycone. Par exemple pour la quercétine 3-O-β-}

galactopyranoside, 5 signaux aromatiques caractéristiques ont été détectés : (δH/ δC (H-2’/C-2’) 7,84/117,8, (H-

6‘/C-6’) 7,58/122,9, (H-5’/C-5’) 6,86/116,1, (H-8/C-8) 6,37/94,8 et (H-6/C-6) 6,18/100,1). La multiplicité et les constantes de couplage (H-2’, d, J= 2,2, H-6’, dd, J= 8,5 et 2,2, H-5’, d, J= 8,5, H-8, d, J= 2,2, H-6, d, J= 2,2) a démontré également la présence d’un système aromatique de type AMX (H-2’, H-5’ et H-6’) et d’un autre cycle aromatique où les protons H-6 et H-8 sont en meta. Les données spectrales de l’analyse HSQC ont aussi permis de confirmer la présence d’une unité hexose (5 CH et 1 CH2).

Figure 42 Structures des flavonoïdes glycosylsés identifiées (* identification partielle)

L’analyse détaillée des constantes de couplages (1_J, 2_J, 3_{J) ainsi que des études RMN 2D (ROESY) ont été}

effectuées pour déterminer la configuration absolue de l’unité glycosylée. Pour la quercétine 3-O-β- galactopyranoside, le spectre RMN 1_{H a révélé la présence d’un triplet à 3,49 ppm (H-4’’, J= 6,2), de 4 doublets}

de doublets à 3,56 ppm (H-6’’-b, J= 11,2 et 6,3), 3,57 ppm (H-3’’, J= 9,7 et 3,4), 3,65 ppm (H-6’’-a, J= 11,2 et 6,0) et 3,83 ppm (H-2’’, J= 9,7 et 7,8) d’un doublet à 3,86 ppm (H-4’’, J= 3,4) et d’un doublet à 5,14 ppm (H-1’’, J= 7,8) qui correspond au proton sur le carbone anomérique. Sa constante de couplage de 7,8 Hz permet de confirmer une configuration anomérique de type β selon l’équation de Karplus qui décrit la corrélation entre la constante de couplage 3_{J et l’angle de torsion (Figure 43). L’expérience HMBC permet de détecter les}

corrélations longues distances (2_JHC, 3_{JHC et} 4_{JHC) entre un proton et un carbone. L’analyse du spectre HMBC}

permet ainsi de voir quel proton couple avec quel(s) carbone(s) à proximité (2 à 4 liaisons). Cette technique a permis de déterminer la position du galactose sur la quercétine, soit sur le carbone C-3.

Figure 43 Détermination de la configuration anomérique d’un hexose selon l’équation de Karplus

La comparaison des données expérimentales à celles dans la littérature a aussi permis de confirmer l’identification des composés.211,212,213,214,215 _{Les déplacements chimiques des protons et des carbones des}

composés identifiés sont présentés au Tableau 12 tandis que les spectres RMN (1_H, 13_{C- DEPTQ, HSQC,}

COSY, HMBC, ROESY) des composés purifiés sont présentés de l’Annexe 7 à l’Annexe 42. Parmi les 15 composés purifiés et semi-purifiés, plusieurs correspondaient à la même molécule (Figure 42), même si des différences de déplacement chimiques et de temps de rétention avaient été observées. Par exemple, pour les composés F1A, F1B et F1G qui correspondent à la quercétine 3-O-β-galactopyranoside, de légères différences de déplacement chimiques pour les carbones portant les hydroxyles (C-9, C-5 et C-2) avaient été observés (Annexe 43). De plus, des temps de rétention de 12,94, 13,77 et 13,82 min ont été obtenus respectivement pour les composés F1B, F1G et F1A. Ces différences peuvent être attribuables à la teneur variable en acide formique dans les échantillons. C’est aussi le cas pour les composés F5B et F5D qui ont des différences négligeables de déplacements chimiques aux niveaux des carbones portant les phénols, ces derniers ont été identifiés comme étant la quercétine-3-O-α-L-arabinofuranoside.

L’analyse des spectres RMN du composé F5C et la comparaison aux données expérimentales à celles de la littérature ont permis de confirmer son identité, soit la quercétine-3-O-α-L-arabinopyranoside.215 _{L’analyse des}

spectres RMN du composé F2B a permis d’identifier que le flavonoïde est aussi formé d’une unité arabinopyranoside et que l’aglycone est la quercétine, mais la structure exacte n’a pas pu être déterminée. En fait, des différences localisées au niveau du cycle aromatique B (C-2’ 109,4 ppm, C-3’ 153,3 ppm, C-4' 157,4 ppm et C-5’ 109,1 ppm) ont été observés par comparaison au composé F5C et aux données dans la littérature pour la quercétine-3-O-α-L-arabinopyranoside. Sur le spectre ROESY de F2B on observe des taches d’échanges entre H-2' de F2B et H-2' de F5C (minoritaire), entre H-5' de F2B et H-5' de F5C et entre H-1'' de

analyses ROESY permettent d’observer l’équilibre entre deux conformères par la présence de taches d’échanges entre deux protons.216

Tableau 12 Comparaison des déplacements chimiques (1_{H et} 13_{C) des flavonoïdes glycosylés isolés}

Position F5B F5C F1G F1C F4C 13_C 1_H 13_C 1_H 13_C 1_H 13_C 1_H 13_C 1_H 1 2 159,3 158,6 158,7 160,5 160,1 3 134,9 135,6 135,8 135,9 134,7 4 180,0 179,4 179,4 179,6 178,7 5 163,1 163,0 162,9 162,9 162,7 6 99,9 6,21, d 100,1 6,19, d 100.1 6,18, d 100,0 6,18, d 101,1 6,13. d 7 166,3 166,7 166,6 166,5 8 94,8 6,39, d 94,8 6,39, d 94,9 6,37, d 94,8 6,39, d 95,6 6,32, d 9 158,6 158,5 158,4 158,9 158,7 10 105,6 105,4 105,5 104,4 1’ 123,1 122,9 122,8 120,5 120,8 2’ 116,8 7,53, d 117,4 7,74, d 117,8 7,84, d 109,3 7,33, d 109,4 7,37, d 3’ 146,4 146,0 145,8 153,4 153,2 4’ 149,9 150,0 149,9 157,5 157,2 5’ 116,4 6,90, d 116,2 6,87, d 116,1 6,86, d 109,1 6,69, d 108,8 6,64, d 6’ 123,0 7,50, dd 123,0 7,58, dd 122,9 7,58, dd 123,2 7,59, dd 123,0 7,58, dd 1’’ 109,5 5,47, s 104,7 5,14, d 105,4 5,14, d 104,9 5,03, d 104,9 5,18, d 2’’ 83,3 4,33, dd 72,9 3,90, dd 73,2 3,83, dd 75,3 3,51, m 75,3 3,55, dd 3’’ 78,7 3,91, dd 74,1 3,64, dd 75,1 3,57, dd 77,8 3,39, t 77,5 3,43, t 4’’ 88,0 3,87, q 69,1 3,82, m 77,1 3,49, t 73,3 3,51, m 72,7 3,58, t 5’’ 62,5 3,49, m 67,0 _{3,82, m} 3,45, 70,0 3,86, d 76,8 3,56, d 77,1 3,75, d 6’’ 61,9 _{3,56, dd} 3,65, dd 176,3 170,5 3,65 (OMe)

Dans le cas du composé F1C, il a été proposé que ce flavonoïde est la quercetine-3-O-β-glucuronopyranoside. Les déplacements chimiques en proton et carbone de l’unité glycosyle et les données de spectrométrie de masse concordent avec un glucuronopyranoside. Des différences de déplacement chimiques au niveau du cycle B ont toutefois été mesurées pour les carbones C-2’, C-3’, C-4’ et C-5’ en comparaison à ceux rapportés dans

la littérature (116,0 (C-2’), 145,0 (C-3’), 150,2 (C-4’) et 116,9 (C-5’)) (Tableau 12).217,218 _{Un hypothèse serait que}

la présence d’acide formique dans l’échantillon peut favoriser la formation d’adduits et/ou de complexes avec le cycle aromatique B, ce qui induit des changements de conformations. La structure exacte du composé F1C n’a pas être confirmée, mais elle est analogue à celle de la quercetine-3-O-β-glucuronopyranoside.

De façon similaire aux composés F1C et F2B, une identification putative a aussi été effectuée pour le composé F4C puisque le même phénomène des différences au niveau des carbones (C-2’ à C-5’) du cycle B a été observé. Selon les spectres RMN, l’unité glycosylée correspond à un ester méthylique d’un acide glucuronique, soit le 6-O-méthyl-β-D-glucuronopyranoside.219,220 _{Plus précisément, la présence d’un CH3 à 3,65}

ppm et l’absence de CH2 sur le spectre RMN HSQC a permis de confirmer que l’unité glycosylée est sous forme

d’ester méthylique. De plus, sur le spectre HMBC, on voit également un couplage entre le carbone C-6’’ à 170,5 ppm et les protons du CH3. Il a aussi été possible de déterminer que l’aglycone est la quercétine par la

présence des signaux caractéristiques d’un système aromatique de type AMX (H-2’, H-5’ et H-6’) pour le cycle B. De plus, l’ion de l’aglycone détecté par HRMS ESI-TOF est aussi caractéristique de la quercétine. La structure exacte du composé F4C n’a pas être confirmée, mais elle est analogue à celle de la quercetine-6-O-méthyl-β- D-glucuronopyranoside.

Purification des tannins et composés phénoliques issus des fractions XAD 2-3 et 4-5 Des ellagitannins et gallotannins plus communément appelés tannins hydrolysables ont été précédemment identifiés dans les feuilles des espèces appartenant à la famille des Betulacées. Les composés les plus communs chez les espèces Betula pubescens, Betula pendula et Betula nana, sont la pédunculagine, la tellimagrandine I, la tellimagrandine II, la casuarictine/potentilline, l’isostrictinine et la casuarininee/stachyurine.221 _{Pour l’espèce Betula pubescens une quarantaine de composés tannins}

hydrolyzables ont été détectés (Tableau 13).169 _{L’analyse de ces composés est assez complexe en raison du}

nombre élevé d’isomères de constitutions/positions (Tableau 13).

Tableau 13 Tannins hydrolysables identifiés dans les feuilles de Betula pubescens

Composés HPLC-ESI-MS (NEG) m/z Isomères

Galloylglucopyranose 331, 663 2 Digalloylglucopyranose 483, 967 2 Trigalloylglucopyranose 635, 465 2 Tétragalloylglucopyranose 787, 393, 617 4 Pentagalloylglucopyranose 939, 469, 769, 393 2 Hexagalloylglucopyranose 1091, 469, 545, 939, 393, 769 2 HHDP-glucopyranose 481, 963 3 Galloyl-HHDP-glucopyranose 633 2 Bis-HHDP-glucopyranose 783, 391 2 Digalloyl-HHDP-glucopyranose 785, 392 2