Investigations bioguidées : inhibition de l’élastase

Il est maintenant bien connu que les polyphénols sont une source intéressante d’ingrédients actifs pour la cosméceutique en raison de leurs propriétés photoprotectives, antioxydantes, anti-élastases, anti-collagénases, anti-tyrosinases et anti-inflammatoires. Parmi les classes de composés polyphénoliques, des activités inhibitrices vis-à-vis l’élastase et la tyrosinase ont été rapportées pour des flavonoïdes, des tannins hydrolysables et des phénylpropanoïdes (Annexe 2).73,232,85,75,90,88,92 _{Les extraits et les fractions enrichies issues}

des feuilles du bouleau glanduleux devraient ainsi démontrer un potentiel à inhiber l’élastase et la tyrosinase puisque les flavonoïdes et les tannins hydrolysables sont les métabolites majoritaires qui ont été identifiés dans les feuilles de cette espèce (voir section précédente). Il est aussi intéressant de spécifier que le potentiel des feuilles de B. pendula à blanchir la peau (anti-tyrosinase) a précédemment été démontrée.232 _{Dans cette étude,}

l’activité antioxydante et anti-tyrosinase a principalement été associée aux flavonoïdes (quercétine, kaempférol, quercétine-3-O-glucoside et quercétine-3-O-galactoside) et aux acides hydroxycinnamiques (acide chlorogénique et acide coumarique).232 _{De plus, la compagnie The Innovation Company a développé un produit}

cosmétique à base d’un extrait de feuilles et de sève de Betula alba.233 _{La formulation permet d’augmenter la}

fermeté de la peau, la microcirculation et le renouvellement de la peau. Ces propriétés seraient associées à la présence des flavonoïdes, des tannins, des saponines et de la vitamine C.234 _{Il a ainsi été envisagé d’évaluer le}

potentiel d’inhibition de l’extrait méthanol et des fractions XAD1 2-3, 4-5, 6 et 7 envers l’élastase et la tyrosinase puisqu’il est fort probable que l’extrait contient des métabolites actifs.

Dans l’essai enzymatique de l’élastase, l’élastase pancréatique de porc hydrolyse le substrat N-succinyl-(Ala)3-

p-nitroanilide, ce qui mène à la libération de la p-nitroaniline. L’hydrolyse enzymatique du substrat a été dosée par spectroscopie d’absorbance à 410 nm. Lorsque des fractions actives inhibent l’élastase, une diminution de l’absorbance dans le temps par rapport au 100 % d’absorbance est mesurée. Selon les résultats obtenus pour l’inhibition de l’élastase (Annexe 79), aucune des fractions XAD1 2-3, 4-5 et 6 n’a permis d’obtenir 50 % d’inhibition à une concentration de 1,5 mg/mL. Dans le cas de l’extrait brut, le 50 % d’inhibition a été obtenu à cette concentration, mais il est probable qu’il s’agisse d’une interférence due à la présence de pigments dans l’extrait. Parmi les 4 fractions qui ont été criblées, c’est la fraction XAD1 4-5 qui a démontré le plus fort potentiel d’inhibition. Les sous-fractions qui ont été obtenues lors du fractionnement test de XAD1 4-5 (Annexe 49) ont ainsi été évaluées pour poursuivre le fractionnement bioguidé. Les graphiques d’inhibition de l’élastase dans le temps en fonction de l’absorbance à 410 nm pour les fractions 5C, 3G, 4H et 1L sont présentés à la Figure 52, en comparaison à celui de l’extrait méthanol et de la fraction XAD1 4-5. Le profil d’inhibition de la fraction XAD1 2-3 qui est concentré en pédunculagine/casuariine, a également été inclus à titre de comparaison. Il a été observé que l’activité inhibitrice du pédunculagine/casuarïne est plutôt faible. En fait pour la fraction XAD1 2-3

purifiée, une activité inhibitrice de plus de 50 % (IC50) a été mesurée à une concentration de 3,0 mg/mL. À une

concentration de 1,5 mg/mL, la courbe d’inhibition de la fraction XAD1 2-3 chevauche celle de la IC50. De façon

générale, les fractions qui ont été obtenues à la suite du fractionnement de XAD1 4-5 ont un profil d’inhibition plus élevée. En fait, parmi les 28 fractions qui ont été évaluées, 15 fractions ont une IC50 inférieure à 50 μg/mL.

C’est le cas par exemple des fractions 5C, 3G, 4H et 1L dont leur profil d’inhibition est présenté à la Figure 52. La fraction 5C est celle qui a démontré le potentiel le plus élevé avec un IC50 inférieur à 2,5 μg/mL.

Pour l’essai d’inhibition de la tyrosinase, la L-tyrosine a été employée comme substrat pour suivre l’activité catalytique de la tyrosinase (champignons). Lorsque cette enzyme n’est pas inhibée, le substrat est oxydé en dopachrome, ce qui mène à la formation d’un complexe coloré. L’inhibition peut ainsi être évaluée par spectroscopie d’absorbance à 475 nm.94 _{Les résultats d’inhibition de la fraction XAD1 4-5 et des sous-fractions}

ont démontré un très faible potentiel vis-à-vis la tyrosinase. À première vue, ces résultats sont plutôt surprenants puisque les tannins hydrolysables sont connus pour être actifs envers cette enzyme. Il pourrait toutefois s’agir de faux négatifs puisque les composés de type phénylpropanoïdes tels que l’acide caféique peuvent induire de l’interférence.94 _{En fait, il est rapporté que certains polyphénols qui ont un motif 4-hydroxy ou 3,4-dihydroxy}

peuvent être hydroxylés et/ou oxydés par la tyrosinase issus des champignons (mushroom tyrosinase, mh-Tyr, 1.14.18.1), ce qui mène à la formation du complexe coloré de la dopachrome. Lors d’un fractionnement bioguidé, la composition en métabolite n’est généralement pas connue. Il est ainsi difficile de conclure si l’absence d’inhibition est due à la présence de substrat de la mh-Tyr, ou si les composés à l’étude ne sont vraiment pas actifs. Il est ainsi préférable d’utiliser ce type d’essai sur les composés purifiés ou sur des fractions dont le profil en métabolites est connu.

En ce qui concerne les résultats d’inhibition vis-à-vis l’élastase qui ont été obtenus lors de ce fractionnement bioguidé préliminaire, ils sont très encourageants. Il a ainsi été envisagé de cribler également les fractions qui ont été obtenues lors des purifications successives de XAD1 4-5 et XAD2 8. Parmi celles-ci, 23 fractions mixtes ont été sélectionnées pour réaliser parallèlement une analyse détaillée de leur profil en métabolites par spectrométrie de masse en tandem. Les résultats de la déréplication par spectrométrie de masse ainsi que les activités inhibitrices de ces fractions sont présentées au chapitre 4 (Déréplication des métabolites et localisation d’actifs cosméceutiques des feuilles de B. glandulosa). En plus de localiser les métabolites actifs, l’objectif est d’identifier les types de composés qui sont associés à l’activité inhibitrice. En sachant quelles classes de composés sont susceptibles d’être actives, des méthodologies de purification ciblée pourront être développées.