Chapitre 1 : Identification de métabolites anti-inflammatoires issus du lichen Stereocaulon paschale
1.1 Investigations phytochimiques antérieures du lichen Stereocaulon paschale
1.1.1 Extraction, purification et identification de métabolites lichéniques bioactifs
Seulement quelques composés dont l’éthyl haematommate, le méthyl-β-orsellinate, l’haematommate, l’acide lobarique et des polysaccharides ont été isolés précédemment du lichen Stereocaulon paschale.117,70 Selon lalittérature, le genre Stereocaulon serait formé de 130 espèces, dont seulement 40 ont été investiguées phytochimiquement, ce qui a mené à l’isolation de 75 métabolites.118,119 Le lichen S. alpinum est l’une des
espèces qui a été la plus étudiée dans le domaine de la pharmacognosie. En effet, des activités biologiques diverses ont été associées aux métabolites de ce lichen telles que des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes, antibactériennes, inhibitrices de la protéine tyrosine phosphatase 1B, inhibitrices de la lipoxygénase et cytotoxiques envers les lignées cellulaires tumorales humaines.120,121,122,123,124 Outre cette
espèce, des activités antioxydantes, antiviral (HCV) et antimitotique ont également été rapportées respectivement chez les lichens S. halei, S. evolutum et S. sasakii.125,126 Il a ainsi été envisagé de réaliser des
investigations phytochimiques sur le lichen S. paschale qui a été collecté dans la région du Nunavik puisque ce dernier a un fort potentiel de contenir des composés bioactifs. De plus, cette espèce a été très peu étudiée, il est donc d’intérêt de déterminer son contenu en métabolites. Finalement, les conditions climatiques extrêmes du Grand Nord du Québec sont susceptibles de favoriser la biosynthèse de métabolites inédits.
Le lichen S. paschale a été extrait par macération en effectuant un gradient de polarité, ce qui a généré trois extraits bruts (hexanes, dichlorométhane et méthanol). L’extrait méthanol a été sélectionné pour effectuer une étude phytochimique approfondie de ces constituants. Un premier criblage chimique des métabolites spécialisés a été effectué par HPLC-UV-ESI-TOF-HRMS afin de tenter d’identifier des composés qui ont été précédemment isolés chez le genre Stereocaulon. Cette procédure de déréplication a permis d’identifier putativement 10 composés en comparant la formule moléculaire qui a été générée à partir du spectre de masse de l’ion moléculaire, à ceux des composés qui ont été précédemment identifiés.70 Plus précisément, il a été possible de
dérépliquer le méthyl-β-orsellinate (8), le méthyl-haematommate (9) et l’acide lobarique (1) qui sont des métabolites fréquemment isolés chez les espèces du genre Stereocaulon (Figure 10). De plus, des métabolites de types pseudodepsidones ont également été identifiés putativement tel que le sakisacaulon A (4), le lobarin
méthylé (5), le lobarin estérifié (2), le sakisacaulon méthylé (6), le sakisacaulon estérifié (3), le sakisacaulon A anhydre (7) et l’acide norlobarique (10) (Figure 10). Ces pseudodepsidones ont été rapportés précédemment dans les espèces S. sasakii, S. azoreumn et S. alpium.
Figure 10 Métabolites identifiés dans le lichen Stereocaulon paschale
La procédure de déréplication a également permis de détecter 3 composés dont la formule moléculaire n’a pu être associée à des métabolites lichéniques du genre Stereocaulon. Afin d’élucider la structure des composés
11-13 potentiellement inédits et de confirmer les structures des composés 1-10 qui ont été dérépliqués, l’extrait
méthanol a été fractionné par chromatographie à moyenne pression (MLPC) en phase inverse. Cette première étape de purification a permis d’isoler directement le méthyl β-orsellinate (8), le méthyl-haematommate (9) et l’acide lobarique (1), soit les composés majoritaires de cet extrait. Des purifications subséquentes ont ensuite été effectuées par HPLC semi-préparative sur les fractions mixtes, ce qui a permis d’isoler à l’échelle du milligramme les composés 2 à 7 et 10 à 13. L’étude de ces composés par RMN 1D et 2D a permis de confirmer la structure des composés 1-10 qui avaient été dérépliqués par HPLC-UV-ESI-TOF-HRMS. De plus, les études de spectroscopie RMN qui ont été effectuées sur les métabolites 11 à 13, ont permis de déterminer qu’il s’agit de dibenzofuranes. Plus précisément, le composé 12 correspond à l’acide isostrepsilique (Figure 10), soit une dibenzofurane qui a été précédemment isolée de la culture du champignon lichénisé Usnea orientalis.127 Pour
le composé 11, le spectre RMN 1H avait un proton aromatique supplémentaire en comparaison à l’acide isostrepsilique (12). En tenant compte de la formule moléculaire C14H12O4 qui lui a été assignée, le métabolite 11
3,7-diol (Figure 10). Les spectres RMN du composé 13 étaient également très similaires à ceux de l’acide isostrepsilique (12), mais les signaux correspondant au groupement hydroxyméthyl (CH2OH) n’étaient pas
présents. Selon la formule moléculaire C15H10O7 et les corrélations HMBC, il a été possible de confirmer qu’il
s’agit aussi d’une nouvelle dibenzofurane, soit le 2,9-diacidecarboxylique-3,7-dihydroxy-1-méthyldibenzofurane (13) (Figure 10).
Les investigations phytochimiques de S. paschale sont les premières qui ont mené à l’isolation de dibenzofuranes de type acide ascomatique issus d’un organisme lichénique entier.127,128,129,130,131 En fait, des
métabolites de ce type tel que l’acide isostrepsilique, l’acide norascomatique (ou acide hypostrepsilique) et l’acide hypostrepsilalique ont été précédemment isolés, mais seulement dans des cultures de champignons lichénisés (Usnea orientalis, Evernia esorediosa et Stereocaulon japonicum).127,128,129,130,131 Miyagawa et al. ont
rapportés que les conditions de cultures induisent un stress osmotique, ce qui peut favoriser la biosynthèse de dibenzofuranes de type acide ascomatique.128 Le fait que les dibenzofuranes 11-13 soient naturellement
présents dans le lichen S. paschale suggèrent que les conditions de croissance extrêmes dans la région de Nunavik peuvent favoriser la biosynthèse de métabolites spécialisés inédits.70
Les métabolites isolés du lichen S. paschale sont aussi susceptibles d’avoir des propriétés antibactériennes. Bhattari et al. ont rapporté que l’acide lobarique et le lobastin (pseudodepsidone) sont actifs envers les bactéries à Gram négatif B. subtilis, et S. aureus.121 En se basant sur ces recherches, l’activité antimicrobienne des
composés isolés de S. paschale a été évaluée envers le champignon Candida albicans et les bactéries Porphyromonas gingivalis et Streptococcus mutans afin d’identifier de nouveaux agents antimicrobiens. Aucun des composés n’a été en mesure d’inhiber la croissance de C. albicans à une concentration de 80 μM. Des activités antibactériennes modérées à faibles ont toutefois été mesurées pour l’acide lobarique (1) et les métabolites de type pseudodepsidone 2-7.70 Parmi les composés évalués, des concentrations minimales
inhibitrice (CMI) et bactéricide (CMB) d’environ 20 μM vis-à-vis P. gingivalis et S. mutans ont été obtenues pour le sakisacaulon A anhydre (7). En plus de ce métabolite, l’acide lobarique (1) et le lobarin estérifié (2) ont aussi démontré un potentiel d’inhibition assez intéressant pour poursuivre l’étude de ces antibactériens naturels.70
1.1.2 Similarités structurelles et considérations biosynthétiques
La co-occurrence de l’acide lobarique et des métabolites de type pseudodepsidones 2-7 dans le lichen S. paschale suggère que ces derniers ont divergés d’une même voie biosynthétique. En fait, cette proposition s’appuie sur le fait que l’acide lobarique (1) est le composé majoritaire dans cet extrait et que les pseudodepsidones 2-7 sont structurellement reliés à la depsidone 1. De plus, il a été précédemment rapporté que le lobarin, une pseudodepsidone, est biosynthétisé via l’ouverture du cycle lactonique de l’acide lobarique.7
Selon le Schéma 1, le lobarin méthylé (5) serait donc formé à la suite de l’hydrolyse de la fonction ester du cycle à 7 atomes de l’acide lobarique, suivie par l’attaque nucléophile du groupement carboxylate sur la cétone, ce qui mène à la lactonisation du cycle aromatique A. L’alcool sur le carbone quaternaire de la chaine alkyle serait ensuite méthylé. Le sakisacaulon méthylé (6) serait quant à lui biosynthétisé via la décarboxylation du cycle aromatique B du lobarin méthylé (5). Le sakisacaulon A (4) résulterait de la déalkylation du méthoxy de la chaine alkyle du métabolite 6. La déshydratation de l’alcool tertiaire de la chaine alkyle mènerait à la formation du sakisacaulon A anhydre (7). Pour les composés 2 et 3, il serait formé aussi à la suite de l’hydrolyse de l’acide lobarique. En fait, une fois que le cycle lactonique est hydrolysé, le groupement carboxylate peut être estérifié pour former le lobarin estérifié (2) au lieu du lobarin méthylé (5). La décarboxylation du cycle aromatique B du lobarin estérifié générerait ensuite la sakisacaulon estérifiée (3).7
Schéma 1 Proposition d’une relation biosynthétique entre les pseudodepsidones 2-7 et l’acide lobarique (1) via les similarités structurales
Le fait que les pseudodepsidones 2-7 soient étroitement reliées structurellement et biosynthétiquement entre elles ainsi qu’avec l’acide lobarique (1), suggère que ces métabolites devraient également avoir des activités biologiques similaires. C’est d’ailleurs ce qui a été mis en évidence lors de l’étude de leur potentiel antibactérien.70 Selon une revue de littérature, des métabolites lichéniques de type depside, depsidone
et pseudodepsidone ont été rapportés comme étant des agents anti-inflammatoires naturels aux cibles multiples. Par exemple, les acides imbricarique et perlatolique (depside) inhibent la mPGES-1, la 5-LO, la COX-1 ainsi que la voie d’activation NF-ĸB.67,68,69 De plus, il a récemment été rapporté par Pyo et al. que l’acide lobarique et
le lobarstin peuvent inhiber l’expression de la protéine d’adhésion aux cellules vasculaires 1 (VCAM-1) via l’inhibition de la voie de signalisation NF-ĸB et la régulation négative du récepteur membranaire TNF-α.132,133 En
se basant sur ces études, il est possible que les pseudodepsidones 2-7 et l’acide lobarique soient également des agents anti-inflammatoires aux cibles multiples. Il a ainsi été envisagé d’étudier le potentiel d’inhibition de ces composés envers diverses cibles pro-inflammatoires.