M. corymbosa
Etant donné l’importance des alcaloïdes dans le domaine pharmaceutique, notamment pour leurs activités antivirales comme nous avons pu le voir précédemment, nous avons cherché à isoler les alcaloïdes de cette plante. Les extraits totaux des alcaloïdes sont réalisés à partir des feuilles et des écorces de M. corymbosa. La comparaison des rendements d’extraction nous confirme que les alcaloïdes sont majoritairement concentrés dans les feuilles (0,035% contre 0,02% dans les écorces) de cette Rutaceae, comme le montrait le criblage phytochimique présenté plus haut (partie II). Le chromatogramme HPLC-UV/MS (figure 28) montre deux alcaloïdes majoritaires, les composés 26 et 27, et plusieurs alcaloïdes minoritaires dont le composé 28. Ces trois alcaloïdes (26 (Rt=7,5’) : 65,1 mg, 27 (Rt= 5,1’) : 8,8 mg et 28 (Rt=11,9’) : 5,5 mg) ont été purifiés par HPLC semi-préparative (S4).
Figure 28. Chromatogramme HPLC-UV/MS de l’extrait alcaloïdique total des feuilles de M. corymbosa (Cou 39) à 254 nm (méthode HPLC-2).
26
[M+H]+= 260
28
127
Le spectre UV, identique pour les trois alcaloïdes isolés (26-28), présente un maximum d’absorption à 246 nm (figure 29) ce qui nous permet de supposer que ces composés sont des furoquinoléines236. Ces composés, comme nous l’avons vu plus haut, sont par ailleurs caractéristiques des Rutaceae.Figure 29. Spectre UV des alcaloïdes identifiés dans les feuilles de M. corymbosa.
6.1. Détermination structurale du composé 26
L’analyse du spectre de masse haute résolution obtenu pour 26, avec un ion pseudomoléculaire [M+H]+= 260,0976, nous a permis de déterminer la masse molaire de ce composé (M=259) de formule brute C14H13NO4([M+H]+
théorique=260,0917). L’analyse des spectres RMN 1D et 2D (annexe 7) nous indique la présence de deux systèmes A/B de deux protons chacun, portés par des groupements aromatiques. Le premier est formé par les signaux intégrant pour un proton chacun à 8,04 et 7,33 ppm. La constante de couplage identique pour ces deux signaux et égale à 9,2 Hz nous indique que ces protons sont en position ortho l’un de l’autre. Le second système AB est formé quant à lui par les signaux intégrant pour un proton chacun à 7,28 et 7,65 ppm. Le déplacement chimique ainsi que la constante de couplage de ces signaux, égale à 2,5 Hz, correspondent aux signaux positionnés sur le cycle furane de ces composés. Enfin, trois groupements méthoxy correspondent aux trois
nm 220 240 260 280 300 320 340 360 380 mAU 0 200 400 600 800
128
singulets intégrant chacun pour trois protons) à 4,01, 4,04 et 4,49 ppm. L’analyse des spectres RMN 13C et RMN 2D HSQC et HMBC nous a permis d’attribuer les signaux des protons et carbones aux atomes correspondants à la skimmianine. Les données des spectres 1H et 13C, présentées dans le tableau 12, sont identiques à celles retrouvées dans la littérature237,238. Ce composé, déjà décrit comme nous l’avons vu plus haut dans le genre Myrtopsis, fut en effet isolé à partir des feuilles de M. sellingii231.
6.2. Détermination structurale du composé 27
Les données spectrales relatives au composé 27 montrent de grandes ressemblances avec celles du composé 26. Leur spectre UV est parfaitement superposable (λmax= 246 nm). La formule brute de 27, C13H11NO3, est déduite de l’analyse du spectre de masse haute résolution qui montre un pic correspondant à l’ion pseudomoléculaire [M+H]+= 230,1881 (pour une masse théorique de 230,2387). Cette masse correspond à celle de la skimmianine (26) privée d’un groupement méthoxy. Le spectre RMN 1H de 27 met en évidence la présence de deux systèmes A/B de deux protons chacun, identiques à ceux observés pour 26, ainsi que deux groupement méthoxy (contre 3 pour le composé 26) correspondant aux singulets intégrant pour 3 protons à 4,42 et 3,36 ppm. L’analyse des spectres RMN 13C et RMN 2D HSQC et HMBC nous a permis d’attribuer les signaux des protons carbones aux atomes correspondants à la γ-fagarine. Les données analysées des spectres 1H et
13C, présentées dans le tableau 12, sont en tous points identiques à celles décrites dans la littérature237,239. Déjà décrites dans le genre Myrtopsis, la γ-fagarine serait également présente chez M. myrtoidea, M. novae-caledoniae et M. sellingii d’après la littérature231.
129
6.3. Détermination structurale du composé 28
Le spectre UV du composé 28 nous indique qu’il s’agit encore une fois d’un dérivé de la skimmianine (26). L’analyse HRMS de 28, avec un ion pseudomoléculaire [M+H]+= 246,0808 permet de déduire la formule brute de cet alcaloïde comme étant C13H11NO4 ([M+H]+
théorique=246,0761). Cette masse correspond à celle du composé 26 privé d’un groupement méthyle. Le spectre RMN 1H de 28 met encore en évidence la présence des deux systèmes A/B de deux protons chacun identiques à ceux observés pour 26 et confirme la présence, comme pour 27, de deux méthoxy correspondant respectivement aux singulets à 3,88 et 4,47 ppm. L’analyse des spectres RMN 13C et RMN 2D HSQC et HMBC nous a permis d’attribuer les signaux des protons et des carbones aux atomes correspondants à l’haplopine. Ce composé, bien connu des Rutaceae, est isolé pour la première fois dans une espèce du genre Myrtopsis à notre connaissance. L’ensemble des données spectrales présentées dans le tableau 12 sont en accord avec les données de la littérature240,241.
130
Tableau 12. Données RMN 1H et 13C obtenues pour les composés 26, 27 et 28 dans le CDCl3(δ
ppm, J (Hz)). 26 27 28 Position 1H 13C 1H 13C 1H 13C 1 N - - - - 2 CIV - 160,7 - 160,7 - 160,7 3 CIV - 103,2 - 104,4 - 103,3 4 CIV - 163,6 - 159,8 - 163,6 4a CIV - 113,3 - 117,8 - 113,6 4b O-CH3 4,49 (s) 60,8 4,42 (s) 59,2 4,47 (s) 60,6 5 CH 8,04 (d, J=9,2Hz) 119,7 7,73 (d, J=8,0Hz) 114,7 7,82 (d, J=9,2 Hz) 119,9 6 CH 7,33 (d, J=9,2Hz) 114,0 7,33 (t, J=8,0Hz) 124,2 7,26 (d, J=9,2 Hz) 115,7 7 Cx - 155,0 7,05 (d, J=8,0Hz) 109,7 - 151,2 7b O-CH3 4,04 (s) 56,9 - - - - 8 CIV - 137,8 - 152,3 - 139,1 8a CIV - 133,3 - 133,6 - 133,5 8b O-CH3 4,01 (s) 61,5 3,36 (s) 56,7 3,88 (s) 61,6 1' CH 7,28 (d, J=2,5Hz) 106,2 7,09 (d, J=2,5Hz) 105,8 7,13 (d, J=2,5Hz) 106,1 2' CH 7,65 (d, J=2,5Hz) 144,0 7,59 (d, J=2,5Hz) 143,4 7,60 (d, J=2,5Hz) 143,9 26 27 28 1 8 8a 7 6 5 4a 4 3 2 2’ 1’131
6.4. Activité des alcaloïdes isolés contre la DV-NS5 RdRp
Les alcaloïdes purifiés sont alors testés individuellement contre la DV-NS5 RdRp. Les résultats préliminaires obtenus avec ces composés à 50, 10 et 1 µM sont présentés dans le tableau 13.
Tableau 13. Pourcentage d’inhibition de la DV2-NS5 RdRp mesuré avec les trois alcaloïdes isolés à partir des feuilles de M. corymbosa, à 50, 10 et 1 µM.
Inhibition de la DV2-NS5 RdRp Alcaloïdes isolés à 50 µM à 10 µM à 1 µM
26 46 ± 2 12 ± 4 1 ± 1
27 37 ± 6 29 ± 4 16 ± 5
28 33 ± 5 28 ± 6 21 ± 4
Nous remarquons tout d’abord que les alcaloïdes isolés sont responsables d’une activité dose dépendante contre la DV-NS5 RdRp. 26, qui inhibe 46% de l’enzyme à 50 µM, est l’alcaloïde testé le plus efficace contre la DV-NS5 RdRp. La CI50
de chacun des alcaloïdes testés est donc supérieure à 50 µM. Les alcaloïdes isolés ne sont donc pas retenus pour approfondir leur évaluation biologique visant à développer un agent antiviral contre la dengue. Ces résultats sont en accord avec la faible activité contre la réplicase du DV observée avec l’extrait alcaloïdique total des feuilles de M. corymbosa (tableau 9).