Internalisation cellulaire 55!

a) MŽcanismes dÕinternalisation cellulaire

LÕŽtape suivante consiste en lÕentrŽe dans la cellule cible et au franchissement de la barri•re que constitue la membrane plasmique. Les petites molŽcules essentielles telles que les acides aminŽs, les sucres et les ions, peuvent traverser la membrane plasmique via des transporteurs, des pompes protŽiques ou des pores. Les macromolŽcules et solutŽs sont quant ˆ eux internalisŽs par un mŽcanisme dÕinvagination de la membrane, suivi de la formation de vŽsicules intracellulaires, appelŽ endocytose. Ce processus Žnergie dŽpendant se subdivise en deux catŽgories : la phagocytose et la pinocytose.

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La phagocytose concerne lÕinternalisation de grosses particules et est un processus spŽcifique ˆ certains types cellulaires (macrophages, monocytes, neutrophiles). La pinocytose est lÕendocytose des fluides et solutŽs et se compose de quatre voies : la macropinocytose, lÕendocytose dŽpendante de la clathrine, la voie cavŽolaire et lÕendocytose indŽpendante de la clathrine et de la cavŽoline (Figure 12). Ces voies, non mutuellement exclusives, diff•rent de par les mŽcanismes de formation des vŽsicules et les protŽines impliquŽes dans ces mŽcanismes, ainsi que par la taille de ces vŽsicules (Conner & Schmid 2003). La macropinocytose est une voie impliquant la formation de grosses vŽsicules endosomales appelŽes macropinosomes, de forme et de taille hŽtŽrog•nes. Elle est initiŽe suite ˆ une Žvagination de la membrane plasmique permettant dÕinternaliser de larges volumes de milieux extracellulaire et donc de grandes quantitŽs de solutŽs. Cette voie est induite par des facteurs de croissance. Les autres voies sont gŽnŽralement initiŽes par lÕinteraction de la molŽcule avec un rŽcepteur cellulaire protŽique ou lipidique (Juliano et al. 2009). Le choix de lÕune ou lÕautre de ces voies dŽpend de la nature et de la taille de la molŽcule ˆ internaliser et du rŽcepteur impliquŽ, mais peut Žgalement dŽpendre du type cellulaire ou de lÕŽtat physiologique de la cellule (Veldhoen et al. 2008).

Une fois formŽ, le complexe ligand-rŽcepteur est ensuite internalisŽ dans une vŽsicule qui bourgeonne de la face cytosolique de la membrane et qui est dŽtachŽe par lÕŽtranglement du col de la vŽsicule, le plus souvent par la GTPase dynamine. La vŽsicule ainsi formŽe transite ensuite sŽquentiellement dans diffŽrents compartiments endomembranaires de pH de plus en plus faible. Le premier compartiment vers lequel convergent les vŽsicules inhŽrentes ˆ chaque voie est lÕendosome prŽcoce. Puis, des Žv•nements de fusion entre vŽsicules, orchestrŽs par les protŽines SNARE (soluble N-methylmaleimide sensitive factor attachment protein receptors), conduisent les molŽcules internalisŽes dans des endosomes tardifs (pH compris entre 5 et 6) ou les lysosomes (pH compris entre 3,5 et 5), ou vers le rŽseau trans- golgien. Alternativement, le rŽcepteur et le ligand peuvent •tre dissociŽs dans lÕenvironnement lŽg•rement acide de lÕendosome prŽcoce et le rŽcepteur peut •tre recyclŽ ˆ la membrane via un endosome de recyclage (Juliano et al. 2011). Le routage de ces vŽsicules et le choix des compartiments de transit sont rŽgulŽs par la famille de GTPases Rab, et par des protŽines qui connectent les membranes entre elles (tethering proteins). Ce routage est Žgalement une Žtape limitante et importante de lÕinternalisation des acides nuclŽiques puisque certaines voies, comme la voie sŽcrŽtoire ou la voie lysosomale sont ˆ Žviter, conduisant respectivement ˆ lÕexport et ˆ la dŽgradation de la molŽcule (Juliano et al. 2009). Certaines Žtudes ont montrŽ quÕil est possible dÕinterfŽrer avec ces voies de routage. Par exemple,

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lÕinhibition de la protŽine kinase A dans des cellules HeLa augmente lÕefficacitŽ de transfection de polym•res branchŽs de polyŽthylenimine (PEI) complexŽs ˆ des oligonuclŽotides, en Žvitant leur routage vers les endosomes tardifs et les lysosomes (ur Rehman et al. 2011). Une stratŽgie consiste Žgalement ˆ coupler des ligands spŽcifiques aux acides nuclŽiques pour reconna”tre un rŽcepteur particulier et induire lÕinternalisation via la voie dÕendocytose associŽe ˆ ce rŽcepteur. La transferrine est une protŽine impliquŽe dans le mŽtabolisme du fer. La voie dÕendocytose empruntŽe par le complexe formŽ entre la transferrine et son rŽcepteur a ŽtŽ caractŽrisŽe comme Žtant la voie dŽpendante de la clathrine. Il a ŽtŽ montrŽ que le couplage de la transferrine ˆ un polycation permet lÕinternalisation efficace du complexe formŽ avec de ADN plasmidique dans des cellules de poulet (Wagner et al. 1990). La spŽcificitŽ de cette approche a ŽtŽ plus tard contestŽe, dans le cadre de lÕutilisation de lipoplexes (complexes entre des liposomes cationiques de lÕADN plasmidique) associŽs ˆ la transferrine pour augmenter leur internalisation. Ces complexes seraient internalisŽs par une voie dÕendocytose indŽpendante du rŽcepteur ˆ la transferrine (Sim›es et al. 1999).

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Figure 12 : Voies dÕendocytose (dÕapr•s Mayor et Pagano 2007).

Il existe cinq mŽcanismes dÕendocytose dŽcrits, qui diff•rent par la taille des vŽsicules, la nature du composŽ ˆ internaliser et les protŽines impliquŽes dans la formation des vŽsicules. La phagocytose et la macropinocytose impliquent de gros remodelages de la membrane plasmique qui font intervenir un rŽseau de filaments dÕactine. Les vŽsicules formŽes par la voie dŽpendante de la clathrine sont tapissŽes de clathrine. Ce manteau de clathrine est ensuite dŽpolymŽrisŽ, et la vŽsicule fusionne avec un endosome prŽcoce (Ôearly endosomeÕ). La voie dŽpendante de la cavŽoline est initiŽe au niveau de microdomaines membranaires hydrophobes, riches en cholestŽrol et glycosphingolipides. LÕexistence du caveosome comme compartiment intermŽdiaire des vŽsicules tapissŽs de cavŽoline est aujourdÕhui controversŽe (Parton & Howes 2010). Il existe plusieurs voies indŽpendantes de la clathrine et de la cavŽoline, et dŽpendantes ou non de la dynamine. Ces voies peuvent impliquer des intermŽdiaires tubulaires dŽrivŽs de la membrane plasmique appelŽs CLIC (Clathrin- and Dynamin- Independent Carriers) ou les GEEC (Glycosyl phosphatidylinositol-anchored protein Enriched early Endosomal Compartments).

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b) StratŽgies dÕŽchappement endosomal

LÕultime barri•re pour lÕacheminement des acides nuclŽiques dans le compartiment cible (gŽnŽralement le noyau ou le cytoplasme) est lÕŽchappement aux endosomes avant le transit dans les lysosomes (Abes, Williams, et al. 2006). DiffŽrentes stratŽgies ont ŽtŽ dŽveloppŽes pour faciliter ou provoquer la libŽration du matŽriel endocytosŽ.

Certains vecteurs cationiques comme la PEI ou des peptides cationiques riches en histidines, poss•dent un fort pouvoir tampon dans une gamme de pH comprise entre 5 et 7,2. Ils induisent donc un import de protons dans lÕendosome, suivi dÕune entrŽe dÕions chlorure et dÕeau, conduisant ˆ une augmentation de la pression osmotique et ˆ la rupture de la membrane endosomale, libŽrant alors le contenu endosomal dans le cytosol (Figure 13B). Ce processus est appelŽ lÕeffet ÔŽponge ˆ protonsÕ (Boussif et al. 1995). En accord avec ce mŽcanisme, la dissociation du complexe entre le polym•re de PEI et lÕacide nuclŽique aurait lieu dans le cytoplasme, par Žchanges avec des composants cellulaires nŽgativement chargŽs et le polym•re (ur Rehman et al. 2013). Cependant, cet effet ÔŽponge ˆ protonsÕ est controversŽ par certaines Žtudes rŽcentes. Une Žtude montre que la membrane lysosomale nÕest pas compl•tement lysŽe lors de la libŽration du complexe PEI-acide nuclŽique et que ces complexes ne sont pas libŽrŽs intacts dans le cytosol, observant plut™t une fuite de lÕacide nuclŽique tandis quÕau moins une partie du polym•re de PEI reste dans la vŽsicule (ur Rehman et al. 2013). De plus, le pH lysosomal nÕest pas augmentŽ dans les vŽsicules contenant du PEI (Benjaminsen et al. 2013). Ces Žtudes sugg•rent la possibilitŽ dÕun mŽcanisme plus fin, impliquant une dŽstabilisation partielle de la membrane endosomale ou la formation de pores, conduisant ˆ une libŽration locale et directionnelle dans le cytosol.

Dans les Žtudes cellulaires, des agents lysosomotropiques sont couramment utilisŽs en co-traitement avec les oligonuclŽotides ou acides nuclŽiques. Les plus utilisŽs sont le calcium, le sucrose et la chloroquine. La chloroquine est une base faible qui sÕaccumule dans les vŽsicules acides et dont les fonctions amines peuvent •tre protonnŽes ˆ pH faible. Cette accumulation conduit ˆ un influx dÕions chlorure et dÕeau et ˆ la dŽstabilisation de la membrane des endosomes et lysosomes. De plus, la chloroquine inhibe lÕacidification et la maturation des endosomes, ce qui permet de retarder la fusion avec les lysosomes (Khalil et al. 2006).

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Une stratŽgie photochimique appelŽe Photochemical Internalization (PCI) est couramment utilisŽe pour provoquer la libŽration du matŽriel contenu dans les endosomes (voir page 64).

Certains lipides ou peptides, dits fusog•nes, sont sensibles au pH, et subissent un changement structural en milieu acide, qui leur permet de fusionner avec la membrane de lÕendosome, ou de la dŽstabiliser. Le lipide neutre DOPE (dioleoyl phosphatidylethanolamine) forme une bicouche stable ˆ pH physiologique et subit une transition de phase pour former une bicouche en structure hexagonale inversŽe, qui fusionne avec la membrane de lÕendosome (Figure 13A) (Wrobel & Collins 1995; Farhood et al. 1995).

De m•me, certains peptides, synthŽtiques ou issus de virus ayant dŽveloppŽ des mŽcanismes dÕŽchappement aux endosomes, sont capables de perturber la membrane endosomale ˆ pH faible. Notamment, un peptide de 20 acides aminŽs, issu de la sŽquence N- terminale de la sous-unitŽ HA-2 de lÕhŽmagglutinine du virus influenza (grippe), est utilisŽ pour assister lÕinternalisation de diffŽrentes molŽcules et provoquer leur libŽration dans le cytoplasme. Une Žtude montre que lÕactivitŽ biologique de la recombinase Cre, couplŽe au CPP Tat, est stimulŽe dans le cas dÕun cotraitement des cellules avec un conjuguŽ Tat-HA2 (Wadia et al. 2004). LÕavantage de cette stratŽgie repose sur lÕinternalisation des deux conjuguŽs dans les m•mes vŽsicules dÕendocytose (macropinosomes dans ce cas) et la dŽstabilisation uniquement des vŽsicules contenant la molŽcule ˆ internaliser (Figure 14), gŽnŽrant une toxicitŽ moindre ˆ celle dÕun mŽcanisme non ciblŽ de dŽstabilisation. Le peptide synthŽtique GALA est un peptide synthŽtique de 30 acides aminŽs, sensible au pH, capable de stimuler la libŽration cytoplasmique de certains composŽs par un mŽcanisme similaire (Sim›es et al. 1999; Khalil et al. 2006; Hatakeyama et al. 2009).

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Figure 13 : MŽcanismes dÕŽchappement endosomal (d'apr•s Gooding et al. 2012).

(A) : La fusion de la membrane liposomale et de la membrane de lÕendosome est facilitŽe par la prŽsence de co- lipides fusog•nes neutres tels que le DOPE dans le liposome cationique. (B) Les polym•res ou peptides cationiques fortement chargŽs, tels que le PEI, se protonnent dans lÕendosome, provoquant un influx dÕions chlorures et dÕeau, provoquant la rupture de la membrane endosomale. Ces deux mŽcanismes aboutissent ˆ la libŽration du contenu de lÕendosome dans le cytosol.

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Figure 14 : MŽcanisme proposŽ pour la libŽration de Tat-Cre dans le cytoplasme, assistŽe par un co- traitement avec un conjuguŽ Tat-HA2 (dÕapr•s Sebbage 2009).

Le co-traitement des cellules avec les conjuguŽs Tat-Cre et Tat-HA2 rŽsulte en la prŽsence des deux types de conjuguŽs dans les m•mes vŽsicules dÕendocytose. Le faible pH endosomal provoque un changement conformationnel de HA2, lui confŽrant la propriŽtŽ de dŽstabilisation des endosomes et induisant la libŽration de Tat-Cre dans le cytoplasme. bleu : protŽine Cre (cargo), violet : CPP Tat, orange : HA2, gris : membrane de lÕendosome.

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Certains mŽcanismes de translocation Žnergie-indŽpendants ont ŽtŽ proposŽs pour lÕinternalisation de certaines molŽcules, dont les CPP (voir page 78), permettant ainsi dÕŽviter la voie endosomo-lysosomale.

De plus, il est intŽressant de noter que la cible peut se trouver dans le m•me compartiment cellulaire que lÕacide nuclŽique endocytosŽ. Par exemple, une Žtude avec un PNA antimiR dirigŽ contre le miARN miR-122, montre que le PNA est internalisŽ par endocytose et que le ciblage du micro ARN a lieu dans des compartiments endosomaux o• les deux molŽcules colocalisent, sans nŽcessitŽ de libŽration du PNA dans le cytosol (Torres et al. 2011).

c) Le noyau : une barri•re supplŽmentaire ?

LÕentrŽe des oligonuclŽotides dans le noyau ˆ partir du cytosol ne constitue a priori pas une barri•re, ce processus Žtant rŽgulŽ par les pores nuclŽaires qui permettent le transport passif de molŽcules jusquÕˆ 70 kDa et 10 nm de diam•tre (Melchior & Gerace 1995). Cependant, il faut souligner que le couplage de lÕoligonuclŽotide ˆ un transporteur augmente sa taille, ce qui constitue potentiellement une limitation pour lÕimport nuclŽaire. Eventuellement, des peptides NLS (signal de localisation nuclŽaire), peuvent •tre utilisŽs pour induire le ciblage nuclŽaire via un import actif par des pores nuclŽaires ayant une ouverture jusquÕˆ 30 nm de diam•tre.

Une endocytose efficace des acides nuclŽiques implique donc trois Žtapes ˆ optimiser : lÕinternalisation, le routage vŽsiculaire et la libŽration des endosomes.

II. 2. StratŽgies non virales dÕinternalisation des acides