Afin de confirmer l’existence des interactions entre le complexe RSC et les ARN polymérases et répondre à la question de leur spécificité, j’ai réalisé des immunoprécipitations des ARN polymérases. Ne disposant pas alors d'anticorps dirigés contre les sous-unités de RSC, nous avons construit différentes souches dans lesquelles les protéines Rsc1 ou Rsc4 ont été étiquetées en position C-terminale par 13 répétitions de l'épitope Myc (Longtine et al., 1998). Les différents allèles étiquetés sont placés soit au locus chromosomique soit sur un plasmide centromérique sous le contrôle de leur promoteur naturel. Il n'y a donc pas de surexpression des protéines qui pourraient "forcer" la co-immunoprécipitation.
Les protéines C11 et τ131 appartiennent au système de transcription par l'ARN polymérase III. On peut donc se demander si RSC intervient spécifiquement dans la transcription par la pol III. Dans un premier temps, nous nous sommes donc consacrés à l'étude des interactions entre le complexe RSC et l’ARN polymérase III. L’immunoprécipitation de l'ARN polymérase III a été faite à partir de souches dérivées de la souche MW671 (rpc160-∆ ::HIS3 pC160-240 (CEN3 URA3 rpc160-240) ;
Dieci et al., 1995) décrite dans le chapitre sur l'interaction de C160 avec ABC27. L'immunoprécipitation a été faite à l'aide d'anticorps dirigés contre l'épitope HA (12CA5) fixés sur des billes magnétiques. L'analyse en western blot des protéines éluées révèle que la protéine Rsc4 est co-immunoprécipitée avec la pol III. Aucun signal n'est détecté à partir de la souche contrôle dans laquelle seule la protéine Rsc4 est étiquetée (figure 28 D). Des résultats similaires ont été obtenus avec la sous-unité Rsc1 (A. Flores-Diaz, communication personnelle).
Le complexe RSC et les ARN polymérases agissent sur de l’ADN nucléosomal. Il est possible que la co-immunoprécipitation de RSC avec l'ARN polymérase III résulte de l'attachement des deux complexes à de l'ADN et non d'une interaction directe. Pour écarter cette hypothèse, j’ai réalisé une digestion à la DNase I sur les protéines retenues par les billes magnétiques. La co-immunoprécipitation de la protéine Rsc4 avec la pol III n’est pas affectée par ce traitement (résultat non présenté).
Les interactions avec les sous-unités communes nous ont conduits à nous intéresser aux liens entre les ARN polymérases I et II et le complexe RSC. Des expériences similaires à celles qui ont été réalisées sur la pol III nous ont permis de montrer que RSC est également co-immunoprécipité avec la pol I (figure 28 B). Le contrôle de digestion à la DNase n'a pas été réalisé mais on peut émettre l’hypothèse que le résultat obtenu sur la pol III peut être extrapolé.
L’immunoprécipitation de la pol II a été faite à partir de la souche Z242 dans laquelle la sous-unité B44.5 est étiquetée avec 3 épitopes HA du côté amino-terminal (Kolodziej et al., 1990). Nous observons également observé une immunoprécipitation de la protéine Rsc1 avec la pol II. Toutefois, un signal est visible, mais plus faible, même en l'absence d'épitopes HA sur la sous-unité B44.5, (figure 28 C). Ce signal résulte d'une fixation non spécifique de la protéine Rsc1 aux billes magnétiques et ne nous permet pas de conclure sans ambiguïté à une immunoprécipitation du complexe RSC avec l'ARN polymérase II.
Nous avons montré que des sous-unités du complexe RSC peuvent être co- immunoprécipitées in vitro avec deux des trois ARN polymérases. Nous ne pouvons pas conclure formellement dans le cas de la pol II. Des liens entre machineries de transcription et de remodelage de la chromatine ont déjà été établis, mais aucune interaction d’un de ces complexes de remodelage avec les ARN polymérases I et III n’a été décrite.
L'ajout des épitopes Myc à l'extrémité C-terminale de la protéine Rsc4 provoque la perte de l'interaction double-hybride avec ABC27. Les interactions double-hybride n’ont pas pu être testées avec les protéines entières. En effet, la protéine Rsc4, fusionnée au domaine activateur de Gal4, ne donne aucun signal en double–hybride avec ABC27. Par contre, les 68 résidus C-terminaux de Rsc4 interagissent fortement en double-hybride avec ABC27 (figures 27 et 29). L'addition de ces épitopes Myc au fragment 558-625 de la protéine Rsc4 entraîne la perte de l'interaction (figure 29). La construction chimérique Gal4AD-Rsc4(558-625)-13Myc est exprimée mais il est
possible que cette chimère adopte une conformation non compatible avec une interaction en double-hybride. Même si les deux protéines n'interagissent plus apparemment en double-hybride, la protéine Rsc4 est immunoprécipitée avec les ARN polymérases. Ceci indique que la perte d'interaction n'est pas totale in vivo, ou
que les deux complexes interagissent via d'autres sous-unités, ce que suggèrent les autres interactions détectées par double-hybride.
La protéine chimérique Rsc4-Myc s'intègre normalement dans le complexe (B. Cairns, communication personnelle). Des données obtenues par G. Gendrel au laboratoire indiquent que l'interaction ABC27•Rsc4 est importante pour la viabilité des cellules. En effet, si l'interaction entre ABC27 et Rsc4 est importante, on peut penser que la délétion de la région d'interaction aura un effet délétère. Conformément à cette hypothèse, la délétion des 68 acides aminés C-terminaux est létale (G. Gendrel, communication personnelle). Toutefois, la partie C-terminale de Rsc4 n'est pas impliquée uniquement dans l'interaction de Rsc4 avec ABC27. En effet, l'équipe de B. Cairns a montré avec une délétion de taille similaire que la protéine Rsc4 tronquée ne s'intègre plus dans le complexe (B. Cairns, communication personnelle). La région carboxy-terminale de la protéine Rsc4 serait donc impliquée dans le ciblage et l'intégration de la protéine dans le complexe RSC ainsi que dans les interactions avec les ARN polymérases. D'autres données de G. Gendrel indiquent que les 3 derniers résidus de la protéine Rsc4 sont déterminants pour l'interaction avec la sous-unité ABC27. La délétion de ces 3 acides aminés induit un phénotype thermosensible et une perte de l'interaction double-hybride (G. Gendrel, communication personnelle).