Nous avons recherché par mutagénèse aléatoire des mutants de la région d'interaction de la grande sous-unité de l'ARN polymérase III avec la sous-unité commune ABC27. Cette étude avait pour but de rechercher des résidus de C160 important pour l'interaction des deux sous-unités et d'étudier les conséquences de la dissociation de la sous-unité ABC27. Nous n'avons malheureusement pas caractérisé de mutations avec un phénotype marqué et provoquant une instabilité thermique de l’enzyme. L'étude que nous avons entamée n'a donc pas permis de fournir des renseignements supplémentaires sur la fonction de la sous-unité ABC27.
La parution de la structure tridimensionnelle de l'ARN polymérase III de
S. cerevisiae a marqué un tournant décisif dans l'étude des ARN polymérases. Les
alignements de séquences nous permettent de proposer une équivalence dans B220 des mutations que nous avons créées dans C160 (tableau IV ; figure 26). Toutefois, compte tenu de la faible conservation de la partie amino-terminale du domaine d'interaction, il est impossible d'aligner précisément les séquences dans cette région. Cet alignement a été fait de manière à n'introduire qu'un grand espace dans la
séquence de C160 en amont du domaine minimal d'interaction (figures 6 et 24). Les équivalences proposées sont donc spéculatives. En revanche, la région carboxy-terminale est bien conservée ce qui nous permet de positionner les mutations avec plus de certitude.
D'après Cramer et al. (2001), les hélices numérotées 45 et 46 constituent un point de contact entre les deux sous-unités. Ces hélices sont constituées de la séquence, extrêmement conservée, VLGIEAARAALYKEV. F. Navarro a isolé au laboratoire des mutations dans la sous-unité ABC27 provoquant la perte de son interaction double-hybride avec les grandes sous-unités. Le positionnement de ces mutations dans la structure tridimensionnelle de l'enzyme montre qu'ils font face à ces deux hélices. Ces données les désignent donc une des zones critiques pour l'interaction des deux protéines. Nous n'avons pas isolé de mutation dans le sommet de ces hélices. Seuls deux des différents acides aminés mutés (localisés dans l'hélice 46) sont à une distance inférieure à 6 Å de la sous-unité ABC27 (A1346 et A1347 dans B220 ; figure 26). La mutation Y1333C (A1346 dans B220) n'affecte pas l'interaction double-hybride. Quant à la deuxième, S1334G (A1347 dans B220), elle est associée à la substitution F1374I dans le mutant que nous avons isolé. La conjonction de ces deux mutations conduit à une augmentation de l'interaction double-hybride. Ne les ayant pas séparées, nous ne pouvons pas conclure si seule l'une d'elles est responsable de ce phénotype. Les résidus qui sont situés au delà de 6 Å sont probablement trop éloignés pour participer directement à l'interaction.
Notre crible n'a pas été exhaustif puisque nous n'avons pas trouvé deux fois la même mutation. Ceci pourrait expliquer que nous n'ayons pas obtenus de mutations dans les résidus mentionnés précédemment. Cependant la forte conservation de ces acides aminés et les données de F. Navarro laissent supposer que ces résidus sont importants pour l'interaction. Il est possible que la mutagénèse de ces acides aminés ne soit pas viable, même à 30°C. Le schéma du crible de sélection que nous avons fait indique que si de telles mutations ont été créées, elles ont été éliminées lors de l'étape d'échange de plasmide. Il serait donc intéressant, à la lumière de la structure
tridimensionnelle de l'enzyme, de reprendre cette étude et de réaliser la mutagénèse de ces acides aminés. Ceci permettrait peut-être d'obtenir des mutants perdant nettement l'interaction et ainsi de compléter l'étude du rôle de la sous-unité ABC27. D'autre part, Cramer et al. (2001) définissent deux zones de contact entre B220 et ABC27, ce qui pourrait permettre de fortement ancrer ABC27 dans l'enzyme. On peut alors penser que la conjugaison de mutations dans chacun de ces domaines est nécessaire pour provoquer la dissociation de la sous-unité.
Étude d'un mutant du complexe RSC chez S. cerevisiae.
Des cribles utilisant la méthode du double-hybride ont été réalisés au laboratoire sur des sous-unités d'ARN polymérases et de facteurs de transcription dans le cadre du projet TAPIR (Two-hybrid Analysis of Proteins Involved in RNA metabolism ; Fromont-Racine et al., 1997 ; Flores et al., 1999). Plusieurs fragments de sous-unités du complexe RSC ont été sélectionnés dans la banque de fragments génomiques (figure 27 ; A. Flores-Diaz, C. Boschiero, H. Dumay et M. Werner données non publiées). Deux fragments chevauchants carboxy-terminaux (acides aminés 533 à 625 et 558 à 625) de la protéine Rsc4 interagissent avec la sous-unité commune d'ARN polymérases ABC27. La sous-unité commune ABC10β interagit avec Rsc1 et la sous-unité spécifique C11 de la pol III avec Rsc58, et la sous-unité Tfc4 (τ131) du facteur de transcription TFIIIC avec les protéines Rsc2 et Sth1.
Le principal écueil lié la technique du double-hybride tient à l'interprétation des données d'interactions. Même si une interaction est réelle, elle n'a pas nécessairement de sens physiologique et il convient donc de prendre d'autres critères en compte comme la localisation cellulaire ou les fonctions des protéines. On ne peut pas non plus exclure que l'interaction de deux protéines se fasse via un partenaire commun. D'autre part, l'expression des protéines sous forme de protéines de fusion peut générer des artéfacts. Enfin, certaines protéines dites "collantes" sont retrouvées fréquemment dans des cribles indépendants et sont éliminées de l'analyse. Les protéines qui ont une affinité pour l'ADN sont également susceptibles d'être sélectionnées en activant la transcription des gènes rapporteurs même en l'absence d'une protéine partenaire. Il convient donc de s'assurer que les partenaires d'interaction ne sont pas autoactivateurs et de confirmer les interactions double-hybride par une autre méthode. Aucun des fragments de sous-unités de RSC présentés sur la figure 28 n’est autoactivateur et n'a été retrouvé à plusieurs reprises
dans les cribles, ce qui indique que l’activation des gènes rapporteurs est bien due à une interaction entre ces deux fragments protéiques. Toutefois, l'existence de ces interactions double-hybride ne préjuge pas de leur signification biologique.
Le complexe RSC appartient à la famille SWI/SNF de complexes de remodelage de la chromatine qui participent à la régulation de la transcription en modulant l’accessibilité de l’ADN à la machinerie de transcription. Ce complexe a la particularité d'être essentiel à la viabilité cellulaire et est au moins dix fois plus abondant que SWI/SNF dans la cellule. Les interactions double-hybride découvertes au laboratoire nous ont conduits à proposer que RSC intervient pour réguler la transcription chez la levure. Mais l'existence d'interactions avec des sous-unités communes d'ARN polymérases (ABC27 et ABC10β) soulève une question sur la spécificité de ces interactions. RSC intervient-il ou non dans la transcription ? Si oui, dans quel(s) système(s). Enfin, les interactions engagées par la sous-unité τ131 du facteur de transcription TFIIIC suggèrent que RSC pourrait intervenir au niveau du promoteur dans les premières phases de la transcription et en cours d'élongation.