Effets de la mutation rsc4-myc sur la transcription par les ARN polymérases

Pour étudier l'impact de la mutation rsc4-myc sur la néosynthèse des ARN, nous avons réalisé comme dans le cas de la souche rsc1-∆, des marquages radioactifs des ARN in vivo. Les expériences présentées dans ce chapitre ont été faites à partir des souches MW671 (rpc160-∆ ::HIS3 pC160-240 (CEN4 URA3 rpc160-240)) et sa dérivée

MW3461 contenant la mutation rsc4-myc. Un premier résultat a été obtenu au laboratoire par A. Flores par marquage à l'uracile tritié. Ses expériences montraient une très légère diminution de la synthèse des ARN après 6 heures de culture à température restrictive.

Nous avons voulu confirmer ce résultat en utilisant la méthode de marquage des ARN par incorporation de 33_{P (Rubin, 1975). Nous avons analysé la néosynthèse}

des ARN à 30° et après 12 et 20 heures de culture à température restrictive. Comme le montre la figure 34, une chute très importante de la quantité de phosphate radioactif incorporé dans les ARN est visible après 12 heures à 37°C (piste 2). La souche de référence (MW671) présente un taux de néosynthèse constant à tous les points de marquage (pistes 4 à 6). La quantité d'ARN marqués à 30°C dans le mutant est légèrement plus faible que celle du sauvage (pistes 1 et 4). Après 20 heures de culture à 37°C, les cellules du mutant rsc4-myc sont quasiment en arrêt de croissance (figure 35), ce qui expliquerait que le taux de phosphate incorporé soit aussi bas et encore réduit par rapport au temps 12 heures. La chute d'incorporation de phosphate est parallèle à une diminution de la quantité de phosphate qui entre dans les cellules (environ 90% pour la souche de référence contre 80% puis 30% et 30% dans le mutant). Deux hypothèses sont envisageables pour expliquer la diminution d'incorporation de phosphate : un blocage de la transcription ou un problème d'entrée et/ou d'utilisation du phosphate.

Nous avons alors décidé d'analyser les défauts transcriptionnels par Northern Blot sur des précurseurs d'ARN ribosomiques et d'ARN de transfert (figure 37 et 38). Ces expériences mettent en évidence une différence dans le profil du mutant

rsc4-myc. L’ARN 35S, transcrit par la pol I, est le précurseur des ARN ribosomiques

18S, 25S et 5.8S. Sa maturation, dont un schéma est présenté sur la figure 36, fait intervenir une série de modifications de bases et clivages. Une cinétique a été réalisée entre 0 et 18 heures de culture à 37°C. La quantité du précurseur 35S a été estimée à l'aide d'une sonde située dans le fragment 5’ A0A1 (Torchet et al., 1998). La mutation

rsc4-myc s'accompagne d'une accumulation de l'ARN 35S. Le niveau de 35S dans le

sauvage augmente au cours du temps de telle sorte que le ratio 35S/18S du sauvage rejoint le niveau du mutant en fin de cinétique (figure 37). Les mutants de l'ARN polymérase III présentent des défauts dans la maturation des ARN ribosomiques (Briand et al., 2001a). Les souches que nous avons utilisées portent un allèle mutant de RPC160, l'augmentation de la quantité de l'ARN 35S résulte probablement d'une interférence de cette mutation dans RPC160 avec la maturation de l'ARN 35S. Cet effet serait augmenté dans le mutant.

L'ARN 20S, précurseur de l'ARN 18S, a été détecté grâce à une sonde située dans sa région 3' (Torchet et al., 1998). Il est moins abondant dans le mutant, mais son niveau reste constant au cours du temps (figure 37). Nous n'avons pas observé de différence significative entre les quantités du précurseur 27S de l'ARN 25S dans les deux souches. L'ARNt Leu (CAA) a servi de contrôle de la quantité de transcrits produits par la pol III. La quantification des ratios 18S/ARNt ne fait pas apparaître de différences significatives entre les deux souches.

Ng et collaborateurs ont recherché par immunoprécipitation de chromatine (ChIP) la localisation de RSC au niveau des régions intergéniques et ont mis en évidence une association privilégiée de RSC avec les régions en amont des gènes transcrits par la pol III (Ng et al., 2002). Il semble que RSC soit difficile à ponter à l’ADN. Plusieurs expériences à partir de sous-unités différentes ont été réalisées. Les

données d’immunoprécipitation ont été ensuite rassemblées et traitées statistiquement de façon à extraire leurs valeurs significatives.

Sept copies du gène de l'ARNt Lys (UUU) sont réparties dans le génome. Ces données de ChIP suggèrent que RSC est présent dans les régions intergéniques en amont de 4 de ces 7 copies. Nous n'avons pas cependant observé de différences notables dans la quantité du précurseur de cet ARNt par rapport à la forme mature (figure 38). De même, le complexe RSC se lierait à 8 des 10 régions intergéniques en amont des copies du gène de l'ARNt Leu (CAA). Mais dans ce cas également, nous n’avons pas observé de diminution de la quantité du précurseur de cet ARNt dans la souche mutante. Ces expériences de Northern blot suggèrent donc qu’il n’y a pas de défauts majeurs de transcription des ARN de transfert par l’ARN polymérase III.

Les expériences de Northern blot ne nous permettent pas de mettre en évidence de défaut de synthèse des ARN ribosomiques et de transfert. Un arrêt de transcription par l'ARN polymérase I est peu probable car cela se traduirait par une disparition des espèces de la voie de maturation. Par contre, nous observons des modifications dans le profil de maturation de l'ARN 35S. La chute d'incorporation de phosphate radioactif observée lors du marquage in vivo semble donc être due à des défauts dans la voie d'utilisation du phosphate (voir partie sur l’analyse du transcriptome et discussion). La présence de plusieurs défauts se traduit par des effets composites et nous empêche de déterminer s'il existe un défaut transcriptionnel. Dans le cas des ARN de transfert, la présence de plusieurs copies des gènes pourraient permettre des compensations et expliquer l'absence de défauts. Toutefois, d'autres données du laboratoire sur ce mutant indique que le complexe RSc pourrait intervenir dans la transcription par l'ARN polymérase III de certains gènes (voir partie discussion).