Inhibiteurs des protéines kinases
Les protéines kinases sont des cibles prometteuses dans le développement de médicaments pour de nombreuses pathologies humaines compte tenu du fait qu’elles interviennent dans un large éventail de signaux de transduction et par conséquence d’activités cellulaires. La stratégie d’inhibition des kinases a été initiée à la fin des années 1980 avec le développement d’inhibiteurs de la protéine kinase de l’EGFR (epidermal growth factor receptor) (Yaish, Gazit et al. 1988). Depuis, un nombre croissant d’inhibiteurs de kinases ont vu le jour sur la base de différent profils pharmacologiques, ou fonctions structurales. Cela s’accompagne par
112 ailleurs d’une augmentation du nombre de publications dédiées à ce champ de recherche (Figure 38) (Wu, Nielsen et al. 2016).
L’approbation de l’imatinib (Gleevec®, Novartis) par la FDA (US Food and Drug Administration) en 2001 pour le traitement des leucémies myéloïdes chroniques n’a pas seulement validé la première thérapie ciblant une protéine kinase, mais a ouvert la voie à l’approbation de 9 autres molécules entre 2001 et 2009 lors de la « sprouting decade of SMKIs » ou la décennie de germination des petites molécules à activité inhibitrice de kinases puis de 19 autres entre 2011 et 2015 (Figure 38) (Wu, Nielsen et al. 2016).
Figure 38 : Tendances et évolution dans le développement de petites molécules à activité inhibitrice de kinases ou SMKIs.
(A) Nombre cumulatif (ligne verte) and nombre par décennies de publications en lien avec les SMKIs. (B) Nombre de molécules SMKIs approuvées par la FDA entre 2001 et 2015. Elles ont été classées en fonction de la famille d’appartenance de leurs kinases cibles. (C) SMKIs approuvées en fonction de leurs compagnies pharmaceutique d’appartenance (Wu, Nielsen et al. 2016).
Parmi ces 28 molécules cliniquement approuvées, nous noterons que la plupart d’entre elles, ciblent des Tyr kinases, quelques-unes ciblent des Ser/Thr kinases ou double spécificité alors que la molécule idelalisib (Zydelig®, Gilead) a été approuvée en Juin 2014 pour son activité inhibitrice sur des kinases lipidique. En général, la recherche académique identifie les composés « hit » et « lead » lors de phases précoces du développement de médicament. Ici, la découverte de SMKIs ou petites molécules à activité inhibitrice de kinases est dominée par quelques compagnies
113 pharmaceutiques incluant Pfizer, GlaxoSmithKline, Novartis, AstraZeneca, Bayé et Boehringer Ingelheim avec plus de 64 % de l’ensemble des molécules approuvées (Figure 38).
Comme précédemment illustré, les protéines kinases partagent un degré de similarité important, tout particulièrement au niveau de la structure 3D de leurs domaines catalytiques. La grande majorité des molécules inhibitrices de kinase approuvées s’ancrent dans la fente catalytique formée par les lobes N et C où les molécules d’ATP se lient (Figure 39). Elles sont divisées en deux groupes selon leur méthode de liaison à la kinase. D’abord l’interaction inhibiteur – kinase peut être irréversible (Figure 39 a). L’inhibiteur va s’ancrer de façon covalente au résidu cystéine le plus proche du site d’ancrage de l’ATP et ainsi bloquer ce site. Ce sont les inhibiteurs de kinase à inhibition irréversible. La liaison peut également être réversible. Dans ce second cas, les molécules sont divisées en 4 sous-groupes selon la conformation que prennent la poche d’ancrage et la boucle activatrice après liaison de l’inhibiteur à la kinase (Figure 39 b).
Figure 39 : Structure d’une kinase et classification des différents types d’inhibiteurs de kinases. Structure co-crystallisée de PDK1 en interaction à l’ATP (adénine et ribose en vert et groupements phosphates en orange). L’image élargie illustre les éléments de structure autours du site de liaison de l’ATP. Les ponts d’hydrogènes sont montrés en tirets rouges, la région de liaison à l’ATP en vert, la boucle P et des résidus de la boucle P en orange-marron, le résidu aspartate de la boucle d’activation en gris. (B) Les quatre types d’inhibiteurs réversibles de kinases sont illustrés. L’inhibiteur est illustré en magenta, le résidu aspartate est représenté en
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blanc. Type I : l’inhibiteur se trouve dans la poche catalytique d’une kinase active. Type II : l’inhibiteur se trouve dans la poche catalytique d’une kinase inactive. Type III : l’inhibiteur se trouve proche mais hors de la poche catalytique de la kinase. Type IV : l’inhibiteur se trouve hors de la poche catalytique de la kinase (Wu, Nielsen et al. 2016).
Les inhibiteurs de Type I exercent une inhibition compétitive à l’ATP en se liant à la kinase sous sa forme active et sur un résidu aspartate de sa boucle catalytique. Les inhibiteurs de Type II se lient à une forme inactive de la kinase. Toujours lié au résidu aspartate de la boucle activatrice qui se trouve dans ce cas éloigné du site de liaison à l’ATP. Pour les inhibiteurs de Type III, la liaison est exclusivement de type allostérique, c’est-à-dire, sans se lier directement au site de liaison de l’ATP mais de façon adjacente à celui-ci. Enfin, les inhibiteurs de Type IV exercent leurs liaisons à la kinase de façon bien plus éloigné du site de liaison à l’ATP, toujours au niveau du domaine catalytique et de façon allostérique.
Parmi les 28 inhibiteurs de kinases disponibles en clinique, 26 font partie de la classe des inhibiteurs réversibles de Type I ou Type II. Le trametininib (Mekinist®, Novartis) étant le seul allostérique de Type III, alors que les deux autres : afatinib (Gilotrif®, Boehringer Ingelheim) et ibrutinib (Ibruvica®, Janssen) sont des inhibiteurs de la famille des inhibiteurs irréversibles (Wu, Nielsen et al. 2015, Wu, Nielsen et al. 2016).
II. DYRK1A
Parmi les 560 protéines kinases humaines connues, nous nous sommes intéressés, dans ce travail de thèse, à la kinase DYRK1A. Dans cette partie, je discuterai de son expression tissulaire, de la structure de la protéine et de ses fonctions. Bien connue pour son rôle délétère dans la trisomie 21 ou Syndrome de Down, je citerai ici quelques travaux permettant de comprendre son rôle lors du développement cérébral humain. Je préciserai son rôle à l’âge adulte en condition physiologique et surtout lors du vieillissement m’amenant à évoquer son lien potentiel avec la maladie d’Alzheimer. Enfin, le développement d’inhibiteurs de cette kinase pour contrer le développement des symptômes liés à la MA sera introduit.
Du gène à son expression tissulaire
Chez l’Homme les paralogues du gène Dyrk1A appartiennent à deux familles : les DYRKS « Dual-specificity Tyrosine (Y) phosphorylation regulated kinases » incluant Dyrk1B, Dyrk2, Dyrk3 et Dyrk4 mais également les HIPKs « Homoeodomain-INteracting Protein Kinase » avec Hipk1,
Hipk2, Hipk3, Hipk4. Ces gènes possèdent des différences que ce soit dans leurs transcrits, leur
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Dyrk1A et Dyrk1B son plus proche paralogue est de 74% et seulement de 41 % entre Dyrk1A et Dyrk2. Alors que l’expression tissulaire de Dyrk1A est fortement localisée dans le SNC et plus
modérément dans les muscles squelettiques et les testicules, Dyrk1B est retrouvée dans les muscles squelettiques, le cœur et les testicules. Enfin, Dyrk2 s’exprime dans les testicules, le foie et le tube digestif (revues (Becker, Weber et al. 1998, Hammerle, Elizalde et al. 2003, Park, Song et al. 2009).
La localisation du gène Dyrk1A a été identifiée dans la région DCR-1 (DSCR) du chromosome 21 humain (HSA21) grâce aux techniques de cartographie physique combinant les banques de YACs, de cosmides et de phages P1 permettant de couvrir de larges régions du HSA21 (Chumakov, Rigault et al. 1992, Soeda, Hou et al. 1995). Plus tard, Guimera et ses collaborateurs précisent sa localisation sur une bande chromosomique 21q22.13 ((Guimera, Casas et al. 1996) ; NCBI/UniSTS). 14 exons ont d’abord été mis en évidence (exons 1 à 14) dont trois non codants (exons 1,2 et 3), puis, 5 autres exons alternatifs ont été identifiés (6a et 6b pour l’exon 6 ; 13a, 13b et 13c pour l’exon 13) (Guimera, Casas et al. 1999). Aujourd’hui, la base de données Ensembl, détaillant et précisant l’ensemble du génome humain, nous renseigne que le gène Dyrk1A humain, appelé Mnbh (ENSG00000157540) s’étend sur 148,5 kb, comporte 16 exons dont la taille varie de 10 pdb (exon 6) à 3467 psd (exon 16). Les introns varient de 136 (intron1A) à 42941 pdb (intron 1B) et 5 isoformes ont été identifiées (Iso1 : 763 aa ; Iso2 : 754 aa ; Iso3 : 584 aa ; Iso4 : 540 aa ; Iso5 : 529 aa).
L’orthologue de Dyrk1A chez la souris est localisé au niveau de la partie distale du chromosome 16 (MMU16) dans une région présentant une colinéarité avec la DCR-1 (Song et al., 1997), 3 isoformes ont été identifiées (Iso1 : 763 aa ; Iso2 : 754 aa ; Iso3 : 763 aa) (Song, Chung et al. 1997). Chez le rat, Dyrk1A se situe quant à elle sur le chromosome 11, un seul isoforme a été décrit (Iso1 : 763 aa) (Kentrup, Becker et al. 1996).
L’expression tissulaire du gène Dyrk1A et de ses transcrits a été analysée par l’intermédiaire de techniques comme le northern-blot, la RT-PCR ou l’hybridation in situ chez différentes espèces (drosophile, souris, rat, Homme, …) à différentes périodes de développement. Chez la souris (mus musculus), deux études ont identifié les transcrits alternatifs de
Dyrk1A et analysé leur expression tissulaire au cours du développement embryonnaire jusqu’à
l’âge adulte. Ainsi des analyses de northern blot, utilisant des banques d’ADNc en libre d’accès, révèlent l’expression de deux bandes de taille différentes (6,0 et 4,0 kb) chez des embryons totaux aux stades embryonnaire : E.7, E.9, E.13, E.15, et E.17. L’hybridation in situ démontre un motif d’expression spatiale et temporele différent lors du développement embryonnaire avec un enrichissement du signal dans la matière grise du cerveau, la moelle épinière et la rétine (Song,
116 Sternberg et al. 1996) (Figure 40). Chez la souris adulte, les deux mêmes transcrits sont détectés par northern blot dans différentes régions incluant le cerveau, le cœur, les muscles squelettiques ou les testicules alors qu’un signal important est détecté dans différentes régions du système nerveux central dont les bulbes olfactifs, le cortex, la couche de cellules pyramidale de l’hippocampe (Guimera, Casas et al. 1996).
Chez le rat (rattus norvegicus), deux bandes de tailles similaires à la souris ont été détectées dans différents tissus étudiés chez des rats nouveau-nés et adultes. En post-natal,
Dyrk1A est retrouvé dans le cortex, l’hippocampe, la moelle épinière avec une forte expression à
P41 (Okui, Ide et al. 1999). A l’âge adulte, les deux transcrits sont retrouvés dans tous les tissus analysés incluant le cerveau, le cœur, les muscles squelettiques, les testicules (Kentrup, Becker et al. 1996).
Chez l’Homme, l’analyse par northern blot nous révèle deux transcrits alternatifs de 6 et 7,5 kb. Le premier, est exprimé dans plusieurs tissus embryonnaires (cerveau, poumons, foie et reins). Ce même transcrit est exprimé à l’âge adulte de façon ubiquitaire mais plus abondante dans le cerveau, le cœur ou les muscles squelettiques (Chen and Antonarakis 1997, Guimera, Casas et al. 1999) (Figure 40).
Figure 40 : Expression tissulaire de Dyrk1A
A Analyse par hybridation in situ illustrant une expression cérébrale sur un embryon de souris à P17,5 : hybridation d’amorces spécifiques de Dyrk1A (E) et hybridation avec amorces
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anti-sens (F) et au niveau de la moelle épinière sur un embryon de souris à P15,5 : hybridation d’amorces spécifiques de Dyrk1A (A) et hybridation avec amorces anti-sens (B). B Analyse par northern-blot de l’expression de transcrits Dyrk1A dans différents tissus humains adultes.
La protéine DYRK1A : de la structure à la fonction
La protéine DYRK1A fait partie des DSKs ou protéines kinases à double spécificité. Elle est cependant à différencier des « vrai » DSKs, qui phosphorylent à la fois des résidus Tyr et des Ser/Thr, puisque DYRK1A va d’abord activer par autophosphorylation ses propres résidus Tyrosines pour catalyser ensuite des réactions de phospho-transferts sur des résidus Serine ou Thréonine comme une « simple » Ser/Thr kinase. Nous décrirons donc dans cette partie sa séquence primaire et ses structures spécifiques qui expliquent pourquoi DYRK1A fait partie de cette classe de protéine kinase. Surtout, nous évoquerons plusieurs études rendant compte de son potentiel rôle chez l’Homme, en fonction de son profil d’expression (âge et localisation) et de la nature des substrats qui l’entoure.
i. Séquence primaire et structure de la protéine DYRK1A
Le gène Dyrk1A code cinq isoformes protéiques dont la plus abondante (DYRK1A-iso1 ; EC.2.7.12.1) est longue de 763 acides aminés pour une masse molaire de 85,6 kDa. Les autres isoformes sont relativement rares dans le cerveau (Guimera, Casas et al. 1999). Nous notons d’abord que les séquences primaires des protéines DYRK1A humaine (n° accès Q13627), de souris (Q61214) et de rat (Q63470) présentent une homologie de 99% (Figure 41).
Ensuite, DYRK1A peut être divisée en trois régions principales comme pour toutes les kinases.
Ainsi, le domaine kinase situé en position centrale s’étend entre les acides aminés 159 et 479. Bien-sûr, il contient l’ensemble des régions conservées du domaine catalytique des kinases et ses 11 sous-domaines selon la classification de Hanks. En plus, des séquences consensus et résidus conservés, participant à la liaison de l’ATP et du substrat communs à toutes les kinases, trois motifs particuliers et spécifiques à toutes les DYRKs peuvent être évoqués (Becker, Weber et al. 1998).
- Le motif His-Cys-Asp-Leu-Lys-Pro-Glu-Asn (aa 285 à 292) du sous-domaine VI b contenant le résidu Cys286 conservé dans toutes les protéines de la famille des DYRKs.
- Le motif Asp-Phe-Gly-Ser-Ser-Cys (aa 307 à 312) du sous-domaine VII avec les résidus Ser310, Ser311 et Cys312 constituant l’empreinte des kinases DYRKs.
- Le motif Tyr319-Gln320-Tyr321 (aa 319 à 321) du sous-domaine VIII identifié comme le
118 Enfin un motif « Leucine zipper » [Leu274-(X)
6-Leu281-(X)6-Leu288-(X)6-Leu295] situé
également dans le domaine catalytique peut être évoqué. Il intervient dans l’établissement d’interactions protéine/protéine et protéine/ADN. La présence d’un tel motif suggère que DYRK1A est capable de former des dimères/multimères complexes incluant des facteurs de transcription et/ou de l’ADN (Song, Chung et al. 1997, Guimera, Casas et al. 1999).
La partie N-terminale de DYRK1A s’étend des acides aminés 1 à 158. Elle comporte une séquence de localisation nucléaire ou NLS pour « Nuclear Localization Signal » contenant les résidus Arg-Arg-His-Gln-Gln-Gly-Gln-Gly-Asp-Ser-Ser-His-Lys-Lys-Glu-Arg-Lys (aa 117 à 134). Cette séquence est reconnue par des protéines cytosoliques telles que les importin-α ou -β qui guident alors DYRK1A au niveau des pores nucléaire pour sa translocation. Un second domaine de localisation nucléaire a été identifié dans le domaine catalytique (NLS2) et serait uniquement présent chez DYRK1A (Alvarez, Estivill et al. 2003).
L’extrémité C-terminale est la partie de DYRK1A lui apportant toute sa spécificité. Elle différencie en effet DYRK1A des autres kinases de la famille des ePKs et même de celles des DYRKs (Figure 41) et s’étend entre les acides aminés 480 à 763. Elle est très riche en sérines thréonines (28%) et possède plusieurs sous-domaines particulièrement intéressants.
- La région PEST pour « Proline/Glutamine/Serine/Thréonine domain » (Pro497 à Pro565)
est à noter. En général, cette séquence intervient dans la dégradation rapide des protéines (Rogers, Wells et al. 1986). Elle est la cible de protéase comme les calpaïnes (1 ou 2). Par exemple, la région PEST est nécessaire et suffisante pour induire la dégradation de la protéine IκBα par la Calpaïne-2, activant ensuite le facteur de transcription NF-κB (Shumway, Maki et al. 1999).
- Deux domaines riches en résidus sérine/thréonine s’étendant respectivement des aa 487 à 524 puis de 635 à 672 (avec une proportion de 63 et 60 % de Ser/Thr). Ces domaines sont conservés chez l’Homme, le rat et la souris mais leurs rôles sont à l’heure actuelle inconnus.
- Deux domaines de répétition de résidus histidine « Histidine repeats » situés entre les deux régions riche en Ser/Thr allant des His599 à His602 puis His607 à His619. Ces deux domaines interviennent dans les processus d’épissage.
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Figure 41 : Structure primaire de la protéine DYRK1A et comparaison aux autres DYRKs humaines
(Partie haute) La protéine DYRK1A humaine est composée de 763 aa organisé en 3 parties distinctes. (A) La région N-terminal (aa 1 à 158) comporte une séquence de localisation nucléaire (rectangle vert). (B) La région correspondant au domaine catalytique est centrale (aa de 159 à 479) (Or entouré de pointillés en or) et contient un domaine de liaison à l’ATP (souligné) ; un motif leucine-zipper (souligné en pointillés) ; les motifs signatures des DYRKs incluant la Cys286 et le triplet Ser310, Ser311 et Cys312 (Rouge et gras) ; le site d’auto-phosphorylation Tyr319-Gln320- Tyr321 (Jaune et Gras et représenté d’un P encerclé) et un second domaine de localisation nucléaire NLS2. (C) La région C-terminale (aa 480à 763) comprend deux séquences riches en résidus Ser/Thr (en violet) ; deux séquences de répétition en histidines (en bleue) et une séquence PEST impliquée dans la dégradation de la protéine (rectangle rouge) (Adapté et modifié à partir des séquences primaires en acides aminés issues de kinase.com).
(Partie basse) Structure primaire de la protéine DYRK1A humaine (isoforme 1 de 763 acides aminés ou 85,6 kDa) et de quelques-uns de plus proches paralogues (Adapté de (Park, Song et al. 2009)).
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