Cette hypothèse va rapidement devenir une philosophie dominante, orientant par la suite la recherche sur cette maladie. Elle souligne l’importance majeure du dépôt d’amyloïde en plaques
52 séniles dans le développement de la MA. La suite de cette partie rendra compte des études qui ont amené John Hardy et d’autres à reformuler peu à peu cette hypothèse.
La composante amyloïde
i. Le métabolisme de l’APP
Les dépôts amyloïdes sont majoritairement constitués de peptides Aβ produits par endoprotéolyse de la protéine APP (Amyloid Precursor Protein). L’APP, dans sa forme entière, est une protéine transmembranaire plutôt mal connue. On la soupçonne d’avoir un rôle dans l’adhésion et le mouvement cellulaire lorsqu’elle est située sur la membrane cellulaire. Mais elle est également localisée à l’intérieur de la cellule et en particulier sur le réseau trans-Golgi, le réticulum endoplasmique et les membranes endosomales, lysosomales et mitochondriales. Dans tous les cas, cette protéine est sensible à une série de clivages séquentiels réalisés par un groupe d’enzymes ou complexes enzymatiques dénommés α-, β-, ou γ-sécrétases. Trois membres de la famille protéique ADAM ont été identifiés comme des protéines à activité α-sécrétase : ADAM- 9, ADAM-10 et ADAM-17. La protéine BACE-1 pour β-site APP-cleaving enzyme 1 est une protéine membranaire intégrale de type I, membre de la famille des pepsines à activité à aspartyl protéase. Elle a été identifiée comme une enzyme à activité β-sécrétase. Enfin, la γ-sécrétase a été identifiée comme un complexe d’enzymes regroupant la préséniline 1 ou 2 associée à la nicastrine, l’APH1 (Anteriror Pharynx Defective) et la PEN2 (Presenilin enhancer 2). Le métabolisme de l’APP est usuellement divisé en deux voies : la voie non-amyloïdogénique et la voie amyloïdogénique (Figure 16).
La voie non-amyloïdogénique est une voie de clivage préférentielle et est observée dans des conditions physiologiques. Ici, l’APP est clivée par l’ α-sécrétase à une distance de 83 acides aminés de l’extrémité C-terminal de l’APP produisant un long ectodomaine N-terminal appelé sAPPα et sécrété dans le milieu extracellulaire. Ce fragment est connu pour son effet neurotrophique in vitro et in vivo (Fol, Braudeau et al. 2015). Le fragment C-ter résultant est retenu à la membrane et clivé par la γ-sécrétase produisant un fragment court appelé p3. Il est à noter que le clivage de l’α-sécrétase est situé dans la région de l’Aβ, empêchant donc sa formation.
La voie amyloïdogénique est une voie de clivage clairement alternative et conduit à la production du peptide toxique Aβ. La protéolyse initiale est, contrairement à la voie non- amyloïdogénique, assurée par la β-sécrétase et située à 99 acides aminés de distance de l’extrémité C-terminale de l’APP. Cette première coupure produit le sAPPβ libéré dans l’espace extracellulaire laissant un fragment de 99 acides aminés (appelé C99) dans la membrane. Le clivage secondaire de ce fragment est réalisé par la γ-sécrétase sur deux sites différents
53 possibles. Le plus long peptide produit est le peptide Aβ1-40. L’autre, diminué en longueur de 10
% est le peptide Aβ1-42. Le variant Aβ1-42 est plus hydrophobe que le premier et plus facilement
sujet à la formation de fibrilles. Cette forme est d’ailleurs retrouvée prédominante dans les plaques amyloïdes. Le peptide Aβ1-40 pourrait même inhiber l’agrégation d’Aβ1-42 (Figure 16).
Figure 16 : Illustration de la production de peptides amyloïdes Métabolisme de l’APP et oligomérisation de l’Aβ (LaFerla, Green et al. 2007).
Les peptides Aβ s’associent facilement et existent sous plusieurs états : monomères, dimères, oligomères, proto-fibrilles, fibrilles. Les fibrilles sont des complexes formés par un processus dépendant de nucléation. Mal compris, les mécanismes responsables de ce processus dans le tissu cérébral vieillissant seraient assimilés aux mécanismes rencontrés dans le « misfolding protein » ou mal-repliement protéique. Dans sa forme monomérique, l’Aβ n’apparaît pas comme neurotoxique. Au contraire, les formes oligomériques et protofibrilles sont considérées comme de puissants neurotoxiques. Enfin, les fibrilles dans leurs états insolubles s’accumulent alors à l’extérieur de la cellule en formant les plaques séniles (Figure 16).
ii. Le peptide Aβ soluble intracellulaire (LaFerla, Green et al. 2007)
L’une des principales critiques de l’hypothèse de John Hardy proposée en 1991 provenait de l’existence d’études cliniques soulignant que la charge en dépôts amyloïdes insolubles et leurs déploiements spatio-temporels ne corrélait que très peu avec les déficits cognitifs. Certains faits vont effectivement dans ce sens : (i) l’imagerie TEP via l’utilisation de ligands de type PiB montrent la présence significative de dépôts amyloïdes chez de nombreux individus âgés cognitivement sains (Villemagne, Burnham et al. 2013) ; (ii) une certaine population japonaise (mutation E693Δ sur l’APP) présente une démence de type Alzheimer associée à une charge en plaques amyloïdes similaire à celle retrouvée chez des patients contrôles. L’augmentation d’oligomères Aβ explique alors leurs symptômes (Tomiyama, Matsuyama et al. 2010) (Figure 17) et (iii) chez l’Homme, la
54 suppression de plaques amyloïdes par l’intermédiaire d’anticorps anti-amyloïde n’est pas associée à une amélioration des capacités cognitives selon des essais cliniques (Holmes, Boche et al. 2008, Doody, Raman et al. 2013, Salloway, Sperling et al. 2014). Au contraire, plusieurs études indiquent que la charge amyloïde soluble corrèle bien mieux avec la sévérité de la maladie (Lue, Kuo et al. 1999, McLean, Cherny et al. 1999). Collectivement, ces données suggèrent donc que l’inducteur clé et initial de la MA serait l’Aβ dans sa forme soluble et non l’Aβ dans son état agrégé formant des plaques amyloïdes extracellulaires.
Figure 17 : Visualisation in vivo de la charge amyloïde dans le cerveau de patients porteurs de la mutation E693Δ
La présence de plaques amyloïdes n’est pas observée chez certains patients MA (forme familiale) souffrant de démence (Tomiyama, Matsuyama et al. 2010). (A) Imagerie IRM. (B) Imagerie PET utilisant le radiotraceur PIB illustrant une charge en plaques amyloïdes similaire entre des patients cognitivement sains (femme de 81 ans)(AC) et des patients atteints de démence de type Alzheimer exprimant la mutation E693Δ (délétion du glutamate 22 de l’Aβ) sur l’APP conduisant à la formation d’oligomère Aβ (femme de 62 ans)(E693Δ). Au contraire, la charge en plaque amyloïdes observée chez les patients MA est bien plus élevée (femme de 71 ans)(AD).
Dans la moitié des années 1980, l’Aβ a d’abord été identifié comme composant principal des plaques amyloïdes présentes dans le milieu extracellulaire. Peu de temps après, un rapport décrit la présence de ces mêmes peptides à l’intérieur de la cellule chez des patients jeunes ou
55 âgés, avec ou sans neuropathologie de type MA. Les observations obtenues soulignent curieusement une prévalence accrue des peptides Aβ à l’intérieur de neurones avec une DNF suggérant ainsi un possible lien entre les deux pathologies (Iqbal, Grundke-Iqbal et al. 1986). L’acceptation de ce concept a été lente et controversée principalement pour des raisons techniques. L’utilisation conjointe de souris invalidant le gène APP et d’anticorps ciblant des « neo-epitopes » ont par la suite permis d’écarter toutes interrogations. Des études récentes ont ensuite suggéré que l’accumulation d’Aβ intracellulaire pourrait constituer un évènement précoce dans la progression de la MA. Chez des patients « MCI », les peptides Aβ intracellulaires sont préférentiellement observés dans les neurones de régions clés de la MA comme l’hippocampe et le cortex entorhinal (Gouras, Tsai et al. 2000). Dans la trisomie 21, l’accumulation intracellulaire est observée avant l’apparition de dépôts extracellulaires (Gyure, Durham et al. 2001). Plusieurs études, dont celle de Gouras précisent que l’Aβ1-42 est bien plus représenté que l’Aβ1-40 dans le
compartiment intracellulaire.
L’APP et ses protéases sont majoritairement localisées sur la membrane plasmique de la cellule expliquant pourquoi la majorité de l’Aβ est sécrété vers l’extérieur de la cellule. Comment pouvons-nous alors expliquer la présence de ce peptide à l’intérieur de la cellule et son rôle délétère ?
Sites de production de l’Aβ intracellulaire. D’abord, le complexe associant l’APP à ses protéases peut, en partie, être localisé sur différentes membranes à l’intérieur de la cellule (réticulum endoplasmique, trans-Golgi, endosome et lysosome). L’une des voies de génération d’Aβ intracellulaire se situe au niveau de l’endosome. Elle s’explique par l’identification récente du gène SORL1 (sortilin-related receptor 1) comme nouveau variant génétique associé à la forme sporadique de MA. La protéine SORL1 régule le trafic de l’APP entre la membrane plasmique cellulaire et l’endosome (retromer recycling endosome) permettant le rétro-transport de l’APP vers le réseau trans-Golgi. L’APP et BACE-1 sont conjointement présents sur les membranes endosomales. BACE-1, dont l’activité est favorisée dans le milieu acide de l’endosome, clive préférentiellement l’APP en Aβ. Certains variants génétiques de SORL1 favorisent le trafic de l’APP vers les endosomes, augmentant d’Aβ intracellulaire et expliquant pourquoi ces variants génétiques sont considérés comme des facteurs de risque pour la forme sporadique de la MA (Rogaeva, Meng et al. 2007). Une seconde voie de production d’Aβ intracellulaire a été identifiée. En retenant l’APP au niveau du réticulum endoplasmique, une étude montre que la production d’Aβ1-40 est inhibée au contraire de celle de l’Aβ1-42 suggérant que ce peptide peut être produit au
niveau du réticulum endoplasmique (Busciglio, Gabuzda et al. 1993). De façon intéressante, ces sites de production sont uniques aux cellules neuronales. En effet, dans les cellules non-
56 neuronales, l’Aβ est uniquement produit au niveau de la membrane plasmique (Hartmann, Bieger et al. 1997) (Figure 18).
Réinternalisation de l’Aβ extracellulaire. La part majoritaire d’Aβ sécrétée hors de la cellule peut être récupérée et internalisée à l’intérieur de cellules « réceptrices ». L’Aβ peut se lier à de nombreuses biomolécules incluant lipides, protéines et protéoglycanes. Pour preuve, après ouverture de la barrière hématoencéphalique, une étude démontre chez la souris que l’Aβ injecté dans la veine caudale est retrouvé à l’intérieur de neurones pyramidaux du cortex (Clifford, Zarrabi et al. 2007). De nombreux transporteurs et récepteurs de l’Aβ ont ainsi été identifiés signifiant qu’une part importante d’Aβ intracellulaire est ré-internalisée. L’Aβ se lie aux récepteurs nicotiniques α7 de l’acétylcholine (α7nAChR) avec une très haute affinité (Wang, Lee et al. 2000). L’utilisation de la bungarotoxine, inhibant la liaison de l’acétylcholine à son récepteur, prévient in
vivo l’accumulation d’Aβ dans certaines régions cérébrales (Oddo, Caccamo et al. 2005). Une seconde liaison peut être citée : l’Aβ se lie directement à la protéine LRP, membre de la famille des récepteurs lipoprotéine à faible densité (LDLR pour low-density lipoprotein receptor). Cette liaison est associée aux récepteurs de l’apolipoprotein E (APOE) modulant l’endocytose rapide de l’Aβ et facilitant sa ré-internalisation (Zerbinatti, Wahrle et al. 2006). Cet effet est bien défini in
vivo puisque la surexpression de LRP augmente l’internalisation d’Aβ1-42 tandis que l’invalidation
d’APOE la diminue drastiquement chez un modèle murin de la MA (mutation sur l’APP). Une large part d’Aβ est ainsi internalisée via le complexe LRP / APOE. L’APOE4 est le facteur de risque le plus fréquemment associé à la MA sporadique, son effet délétère s’expliquerait donc, au moins en partie, à son implication dans l’accumulation d’Aβ intracellulaire.
L’internalisation de l’Aβ est médiée également par le récepteur « collecteur de déchets protéique » RAGE (scavenger receptor for advanced glycation and ends products) (Deane, Du Yan et al. 2003). Dans les neurones, son internalisation induit du stress oxydatif neuronal et active NFκB qui conduit in fine au recrutement accru de cellules microgliales. Dans les cellules astrocytaires de patients MA, le complexe Aβ-RAGE est internalisé et localisé dans les voies lysosomales. Les effets de l’internalisation d’Aβ sont donc vraisemblablement différents d’un type de cellule à l’autre.
L’internalisation d’Aβ par les cellules gliales semble être plutôt bénéfique, du moins dans un premier temps. Ces cellules contribuent en effet à la dégradation d’Aβ et par conséquence à la diminution de sa concentration dans le neurone et dans le milieu extracellulaire. L’internalisation d’Aβ soluble est réalisée par macropinocytose à phase fluide insaturable (Mandrekar, Jiang et al. 2009). Cette dernière est dépendante du dynamisme des protéines du cytosquelette : actine et tubuline. Au contraire, l’internalisation des fibrilles d’Aβ implique l’assemblage de clathrine,
57 vésicules « enrobées » et cholestérol membranaire base de l’endocytose. A l’image des plaques amyloïdes, l’Aβ est capable d’initier la réponse inflammatoire via l’activation de la microglie et des astrocytes. Oligomères et fibrilles auraient des effets différents sur les voies d’activation microgliale mais ces premiers pourraient stimuler la production de cytokines/interleukines inflammatoires et réduire progressivement la capacité phagocytaire des cellules microgliales en se liant au récepteur à protéine G : FPRL1. Son internalisation cytosolique est rapide dans les macrophages et peut être visualisée aisément par le marquage d’Aβ agrégés au rouge Congo (Polanco, Li et al. 2018).
Au contraire, l’internalisation d’Aβ neuronale est délétère.
Rôle pathologique de l’Aβ intracellulaire (Figure 18). A l’intérieur du neurone, l’Aβ est localisé dans les membranes de multiples vésicules (MVBs). Il a été montré que cette liaison perturbe le trafic cytosolique des MVBs. Le système ubiquitine-protéasome utilisant ces MVBs est donc atteint. Ce système regroupe diverses protéines et trouve son rôle dans la dégradation et le recyclage de protéines mal repliées ou superflues. L’ubiquitine est utilisée ici comme « marque » ou « tag » des protéines à recycler. De façon intéressante, l’une des fonctions délétères de l’Aβ intracellulaire est liée à la perturbation du protéasome. In fine, son activité perturbée, le protéasome ne peut assurer la prise en charge d’éléments nécessitant d’être recyclé comme par exemple les protéines Tau hyperphosphorylées. Un lien entre l’Aβ intracellulaire et la composante Tau peux alors en partie être expliqué par un protéasome défectueux (Oddo, Caccamo et al. 2006).
L’accumulation d’Aβ est observée également au niveau mitochondrial. L’organelle regroupe tous les enzymes du complexe γ-sécrétase. L’accumulation progressive d’Aβ à l’intérieur de celle-ci est associée à la diminution de l’activité enzymatique de la chaîne respiratoire III et IV et réduit le taux de consommation d’oxygène (Caspersen, Wang et al. 2005). Des observations identifiant la présence de multiple défauts mitochondriaux sont en effet décrites chez les patients MA.
Il est également largement reconnu que les peptides Aβ créent des puits à l’intérieur de la membrane plasmique produisant de véritables canaux cationiques non spécifiques et artificiels mais permettant l’influx majeur de Ca2+ extracellulaire vers l’intérieur de la cellule. Les
conséquences de cette dérégulation calcique peuvent être majeures puisque les voies de signalisation calciques contribuent largement au maintien de processus médiant l’apprentissage et la mémoire. Ainsi, de nombreuses preuves font état de l’effet de l’Aβ intracellulaire dans le dysfonctionnement synaptique. Chez la souris (3xTg-AD), l’accumulation intraneuronale d’Aβ entraîne dès 4 mois des déficits cognitifs. A cet âge, le dépôt extracellulaire insoluble d’Aβ n’est
58 pas observé tout comme l’apparition de protéines Tau hyper- ou anormalement phosphorylées. L’immunothérapie anti-Aβ supprimant l’Aβ intracellulaire rétablit les fonctions cognitives. L’Aβ perturbe donc la LTP (Potentialisation à long terme) mesurée par études électrophysiologiques et représentant un niveau de plasticité synaptique, base de la mémoire et de l’apprentissage (Billings, Oddo et al. 2005). Ceci peut s’expliquer du fait que l’Aβ se lie au récepteur NMDA (N- methyl-D-aspartate), récepteur clé dans le maintien de la plasticité synaptique. L’utilisation d’antagonistes NMDA comme la mémantine, prévient le déclin cognitif chez la souris suggérant que l’Aβ par sa liaison aux récepteurs NMDA perturbe l’activité synaptique.
La dérégulation calcique intracellulaire peut également activer certaines protéines kinases de la famille des CAMKs, modulant entre autre la kinase GSK3β, également impliquées dans la phosphorylation des protéines Tau. En plus, certaines protéases, dépendantes du calcium comme les calpaïnes, sont dérégulées et protéolysent de façon pathologiques de nombreuses protéines (dont GSK3β ou DYRK1A) exacerbant potentiellement leurs effets (ces protéines interviennent dans la phosphorylation de Tau). Ces données suggèrent donc que la dyshoméostasie calcique intracellulaire pourrait agir comme lien entre la composante amyloïde et la composante Tau.
L’ensemble des éléments cités plus haut n’est pas exhaustif. Il s’agit ici de démontrer que l’Aβ intracellulaire possède des cibles multiples et perturbe ainsi le fonctionnement neuronal à de très nombreux niveaux.
59
Figure 18 : Effets pathologiques de l’Aβ intraneuronal
Lien entre Aβ intracellulaire et extracellulaire. La dernière question que j’aborderai au sujet de la physiologie de l’Aβ intracellulaire est de savoir si cette part est corrélée en quantité ou non à l’Aβ extracellulaire. Les données d’étude chez l’Homme sont contradictoires. Par immunohistochimie, il a été démontré que les régions cérébrales avec une accumulation importante en Aβ intracellulaire montrent également la présence évidente de neurones lysés suggérant une dispersion d’Aβ intracellulaire issus de ces neurones dans l’espace extracellulaire. Chez des patients atteints de trisomie 21, l’inverse a été observé. Chez la souris, l’utilisation d’immunothérapie contre l’Aβ montre une diminution de charge amyloïde extracellulaire rapidement suivie d’une baisse de l’Aβ intracellulaire. A l’arrêt du traitement, l’Aβ intracellulaire réapparaît avant l’Aβ extracellulaire (Oddo, Billings et al. 2004). Ces données suggèrent donc que l’Aβ extracellulaire prendrait son origine de la fraction présente dans la cellule et qu’un équilibre dynamique existerait entre les deux « formes ». Lorsque la forme extracellulaire diminue, la forme intracellulaire pourrait être évacuée vers l’extérieur de la cellule.
Proteasome Mitochondria Ab Tangles Amyloid plaques ROS Ca2+ dysfunction Ab Ab dimer Ab trimer Synaptic dysfunction P P P P P P Oligomers Hyper- phosphorlated tau
studies suggest that the brain of patients with early stage AD might have more abundant intraneuronal Ab, which then becomes extracellular as the disease progresses and neuronal death and lysis occur. Therefore, AD brains coming to autopsy are usually advanced end-stage brains, in which intraneuronal Ab has relocated to the extracellular pool.
Other environmental and pharmacological factors can modulate the intraneuronal Ab pool. We recently showed that dietary treatment of 3xTg-AD mice with docosahexaenoic acid, an n-3 polyunsaturated fatty acid, significantly reduces the soluble Ab pool and intra- neuronal Aβ immunoreactivity115. This same treatment has been shown to improve behaviour and pathology in other mouse models of AD116,117. Insulin signalling also reduces intraneuronal Ab, by increasing trafficking to the plasma membrane where it is secreted118. Whether or not reducing intraneuronal Ab without affecting or increas- ing the extracellular pool is beneficial for AD remains to be determined. However, it is likely that both pools contribute to cognitive decline, and there is a complex relationship between the two pools and the various aggre- gation states of the peptide. For example, 3xTg-AD mice that repeatedly learned to locate a hidden platform in the Morris water maze show improved cognition compared to animals that were not trained119. More significantly, this learning alters the dynamics between intraneuronal Ab, extracellular plaques and Ab oligomerization. Learning increased intraneuronal and soluble Ab, but decreased extracellular and oligomeric Ab, with the net effect being improved cognition. Thus, the reduction in extracellular and oligomeric Ab was highly beneficial, despite increases in intraneuronal Ab in aged mice with established extra- cellular Ab pathology. Other factors have been shown to raise intraneuronal Ab, and are associated with increased risk of AD. These include stress hormones120, increased dietary cholesterol121, oxidative stress122, homocysteic acid123 and the presence of the APOE*e4 allele75, whereas knocking out ApoE decreased intraneuronal Ab.
Conclusions
There is now abundant evidence from many laboratories to document the occurrence of intraneuronal Ab in the normal and diseased human brain. Ab accumulation within neurons wreaks havoc on a range of cellular properties, and evidence from transgenic mouse stud- ies suggests that it can disrupt synaptic activity, lead to proteasome dysfunction, cause calcium dyshomeostasis,
and even facilitate hyperphosphorylation of tau (FIG. 3). Nevertheless, many important questions remain to be addressed, including which assembly state of Ab pre- dominates intraneuronally, and which state exerts the most potent effects on synaptic plasticity, learning and memory, and other cellular functions. It will be crucial to determine whether cells from younger individuals are also better able to neutralize the potential adverse effects of intracellular Ab, perhaps through more efficient clearance or through a chaperone-mediated process. Moreover, other future experiments will need to deter- mine the biophysical assembly states of the intraneuro- nal species, particularly with regards to which state best correlates with pathology and cognitive decline.
Figure 3 | Pathological effects of intraneuronal Ab. Amyloid-b (Ab), produced intracellularly or taken up from extracellular sources, has various pathological effects on cell and organelle function. Intracellular Ab can exist as a monomeric form that further aggregates into oligomers, and it may be any of these species that mediate
pathological events in vivo, particularly within a
dysfunctional neuron. Evidence suggests that intracellular Ab may contribute to pathology by facilitating tau hyper- phosphorylation, disrupting proteasome and mitochondria function, and triggering calcium and synaptic dysfunction. ROS, reactive oxygen species.
1. Alzheimer A. Über eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde. Allgemeine Zeitschrift für Psychiatrie und Psychisch-Gerichtliche M edizine 6 4 , 146–148 (1907). 2. Glenner, G. G. & Wong, C. W. Alzheimer’s disease:
initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1 2 0 , 885–890 (1984).
3. M aster s, C. L. et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl Acad. Sci. USA 8 2 , 4245–4249 (1985).
4. Goedert, M ., Wischik, C. M ., Crowther, R. A., Walker, J. E. & Klug, A. Cloning and sequencing of the