2.1) Instrumentation et spécificités du matériel en HR-MAS

Le rotor est un des éléments importants dans une expérience RMN puisque c’est à l’intérieur de celui-ci qu’est placé l’échantillon et il doit être conçu de manière à pouvoir supporter des

5 Console Unité de refroidissement Sonde Aimant Passeur d’échantillons Unité pneumatique

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vitesses de rotation pouvant atteindre 15 kHz. Les rotors utilisés en RMN HR-MAS sont construits sur la base de ceux utilisés en RMN solide. Ces rotors en ZrO₂ dont le diamètre est de 4 mm existent sous différents volumes effectifs pour l’échantillon, les plus utilisés étant les rotors de 12 µl et 50 µl. Cependant, ces rotors présentent le désavantage de devoir être nettoyés à chaque changement d’échantillon. Afin de remédier à ce problème des rotors de 96 µl ont été développés dans le but de permettre l’insertion d’un insert jetable hermétique (fermé à l’aide d’un capuchon et d’une vis) de 33 µl en Kel-F à l’intérieur de celui-ci évitant ainsi toute contamination ou fuite de solvant. C’est ce type de rotor que nous avons utilisé pour l’ensemble de nos analyses et une vue schématique de l’ensemble du dispositif est donnée en Figure 17.

Figure 17 : Schéma du dispositif HR-MAS avec insert jetable (représenté en bleu) de 33 µl en Kel-F situé à l’intérieur d’un rotor. Ce dispositif est composé d’un capuchon et d’une vis permettant de rendre l’insert hermétique. Le rotor est alors fermé à l’aide d’un autre capuchon (ailettes) permettant la mise en rotation rapide du rotor.

I.2.1.b) La sonde HR-MAS

La sonde HR-MAS possède un rôle essentiel dans les performances d’un système HR-MAS. L’élément fondamental de la sonde est le stator qui contient la bobine radiofréquence dans laquelle est placé le rotor. La bobine utilisée est un solénoïde et non une bobine en « selle de cheval » également appelée bobine de Helmholtz, utilisée pour les sondes liquides. La bobine solénoïde présente, en effet, une meilleure sensibilité et une meilleure distribution du champ B₁. De plus, la bobine solénoïde est mécaniquement plus résistante et ainsi supporte plus facilement les conditions sévères imposées par la mise en rotation de l’échantillon à haute

Ailettes Vis

Capuchon

Volume pour l’échantillon

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vitesse. Le stator est conçu de telle manière que celui-ci soit aligné avec le champ magnétique statique B₀ lors de l’insertion ou l’éjection du rotor, et qu’il puisse être basculé mécaniquement à l’angle magique pendant l’expérience RMN.

De plus, comme pour les sondes haute résolution liquide, il est nécessaire que la sonde soit équipée d’un canal 2

H. Le rôle de ce canal est de fournir une fréquence de référence pour le verrouillage champ/fréquence (« lock ») qui permet de corriger la déviation du champ magnétique principal au cours du temps par une bobine additionnelle qui produit un champ magnétique ΔB colinéaire à B0 qui compense les variations de celui-ci.

Enfin, la principale amélioration des sondes HR-MAS par rapport à une sonde MAS classique est l’introduction d’une bobine gradient sur le stator qui permet de générer des gradients de champ magnétique linéaires dans la direction de l’angle magique123

et ainsi l’utilisation de l’ensemble des séquences monodimensionnelles ou multidimensionnelles utilisées en RMN liquide haute résolution. En effet, les gradients de champ magnétique ont un rôle capital dans ces expériences du fait de leur excellente efficacité pour la sélection des chemins de cohérence et pour la suppression de certains artefacts, notamment la suppression du « bruit t1 » pour les expériences multidimensionnelles.

L’ensemble des spectres des différents échantillons étudiés en HR-MAS ont été enregistrés à l’aide d’une sonde 4 mm Bruker HR-MAS DVT muni de gradient Z et composée de 2 canaux d’observation (1

H et ¹³C) et d’un canal 2

H pour le « lock ». L’intérêt d’une sonde DVT vis-à-vis d’une sonde HR-MAS classique est qu’elle permet une régulation en température permanente indépendante de la rotation (du drive), contrairement aux sondes classiques qui ne régulent plus la température au sein de la bobine lorsque la rotation cesse. Ainsi, même sans mise en rotation, les échantillons sont maintenus à la température souhaitée. Le refroidissement de l’air injecté au sein de la sonde est assuré par une unité de refroidissement BCU II (Bruker Cooling Unit).

I.2.1.c) L’ajustement de l’homogénéité du champ magnétique en HR-MAS

Afin de corriger les inhomogénéités du champ magnétique B0, celui-ci est équipé de bobines additionnelles spéciales appelées « shims », qui produisent des champs magnétiques inhomogènes qui viennent se combiner à B0 afin d’obtenir un champ homogène. Ces inhomogénéités proviennent des caractéristiques de la bobine supraconductrice (longueur,

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forme, connexions), des perturbations extérieures, de la sonde (structure et constituants internes) et de l’échantillon. A la différence de la RMN liquide haute résolution, la technique HR-MAS ne dispose pas encore de procédures de méthodes de réglage automatique des « shims » tel que le « gradient shimming », cette étape doit donc être réalisée manuellement par l’utilisateur. En effet, l’ajustement de l’homogénéité du champ magnétique d’une sonde RMN HR-MAS diffère de celui d’un sonde liquide classique du fait de la rotation rapide de l’échantillon et de l’axe de rotation qui ne se trouve pas aligné avec le champ magnétique principal¹²⁴. Les « shims » dans un système d’axe orienté suivant l’angle magique peuvent être exprimés en fonction de ceux utilisés dans le système d’axe du laboratoire. Les principaux « shims » à régler en HR-MAS sont donnés en Tableau 1¹²⁴.

Cependant, pour un échantillon à l’angle magique et dans le cas d’une sonde HR-MAS avec un stator positionné dans le plan (x,z), seul l’ensemble des « shims » , et sont suffisants pour ajuster convenablement l’homogénéité du champ magnétique d’un échantillon une fois que les autres « shims » ont été préalablement réglés lors de l’installation de la sonde¹²⁵.

D’un point de vue pratique, le niveau de « lock » peut être un bon moyen de régler les différents « shims », surtout pour les échantillons ne contenant pas d’eau tel que le chloroforme qui est le plus couramment utilisé. Cependant pour les échantillons contenant de l’eau, il est préférable de réaliser cette procédure en ajustant en temps réel l’allure d’un pic de référence tel que le TSP ou le TMS ou celui un métabolite de référence : des gradients de température pouvant apparaître avec la rotation du rotor¹²⁵.

70 Premier ordre Deuxième ordre Troisième ordre

Tableau 1 : Principaux « shims »(trois premiers ordres) exprimés dans le repère orienté à l’angle magique jusqu’au troisième ordre en tant que combinaisons linéaires des « shims » dans le repère du laboratoire.¹²⁴

I.2.1.d) Le passeur d’échantillon HR-MAS

Quel que soit le domaine d’application de la RMN, la plupart des études, en particulier celles métaboliques, nécessite le passage d’un grand nombre d’échantillons. En fonction des besoins ou des objectifs des laboratoires, la possibilité de pouvoir réaliser de multiples analyses lorsque l’utilisateur est absent ou occupé, est devenue une nécessité. Pour cela,

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l’automatisation des différentes étapes entre la préparation de l’échantillon et la fin de son analyse (transfert au sein du spectromètre, réglage de l’accord en fréquence et en impédance de la sonde, ajustement de l’homogénéité du champ magnétique principal, détermination des durées d’impulsion, acquisition et traitement des données) est requise. Ainsi, des passeurs d’échantillons automatiques, réalisant ces opérations ont été conçus par la société Bruker. Afin de piloter ce robot dans les différentes tâches que celui-ci doit effectuer un logiciel (IconNMR) a également été développé.

Dans le cas de la RMN HR-MAS, le passeur assure l’insertion des rotors depuis un compartiment réfrigéré vers le spectromètre à travers un tuyau, qui est guidé par une unité pneumatique. Une fois l’échantillon analysé, celui-ci effectue le chemin inverse. Cependant, à la différence des sondes RMN liquides, celles employées en HR-MAS ne sont pas équipées de dispositifs permettant le réglage automatique de la syntonisation de la sonde. De plus, comme nous l’avons vu précédemment l’homogénéité du champ magnétique ne peut être ajustée automatiquement en RMN HR-MAS. Ainsi, l’utilisation d’un tel dispositif est restreinte à l’analyse d’échantillons possédant des propriétés similaires et préparés dans des conditions équivalentes.

Une photographie du passeur d’échantillons utilisé pour la réalisation d’une partie des travaux de cette thèse est donnée en Figure 18.

Le passeur d’échantillons que nous avons utilisé en RMN HR-MAS est un Sample-Pro (Bruker BioSpin) permettant le refroidissement et la régulation en température des rotors avant leur insertion au sein du spectromètre. Ce système assure également le changement de rotors entre les expériences. La vitesse de rotation est fixée à 5000 Hz pour l’ensemble des acquisitions HR-MAS afin de maintenir les bandes de rotation à l’extérieur de la zone d’intérêt du spectre RMN. Tous les spectres RMN ont été enregistrés à une température de 4 C afin de minimiser la dégradation des échantillons de poisson pendant l’acquisition (éviter l’évolution de la valeur K notamment, comme nous le verrons plus tard dans ce manuscrit).

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Figure 18 : Photographie du passeur d’échantillons HR-MAS Sample Pro. Celui-ci est composé d’un compartiment réfrigéré au sein duquel les rotors sont stockés jusqu’à leur analyse. Une unité pneumatique assure le passage via un tuyau des rotors jusqu’au spectromètre au sein de la sonde.