2.2)HSQC

II.2.2)HSQC

L’expérience HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation)51

est largement utilisée pour enregistrer des spectres de corrélation à une liaison entre un hétéro noyau (¹³C, ¹⁵N) et un proton. Au cours de celle-ci, les transferts d’aimantation sont réalisés à l’aide de séquences INEPT¹⁴² (Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer) et l’aimantation de l’hétéro noyau évolue dans un état simple quantum pendant la période d’évolution t1. Le plus souvent, les séquences HSQC sont acquises en détection inverse, qui consiste à obtenir dans la dimension F1 (indirecte) les paramètres RMN (couplage, déplacement chimiques…) d’un noyau peu sensible et de détecter le signal RMN d’un noyau plus sensible grâce à un transfert d’aimantation. Le transfert de polarisation permet un gain de sensibilité équivalent à:

Où I représente le noyau sensible (généralement ¹H ou ¹⁹F) et S le noyau à faible abondance et faible rapport gyromagnétique (¹³C ou ¹⁵N). Le gain de sensibilité permet l’obtention d’un spectre équivalent en signal/bruit à celui obtenu en détection directe mais avec un nombre d’accumulations bien inférieur. Cependant, il est nécessaire d’échantillonner une gamme de

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fréquences plus large dans la dimension F1 que dans le cas d’une détection directe (environ 6 kHz pour le proton contre environ 30 kHz pour le ¹³C).

La séquence HSQC utilisée pour l’attribution des différents métabolites (par RMN liquide et HR-MAS) est donnée en Figure 25. Cette séquence est, tout d’abord, composée d’une présaturation du solvant par irradiation continue pendant TR puis d’un motif INEPT afin de transférer l’aimantation des spins I vers les spins S. Le motif INEPT correspond à une première impulsion 90 qui va basculer l’aimantation dans le plan transversal, puis d’un écho de spin pendant lequel les aimantations ne vont évoluer que sous l’influence du couplage (les déplacements chimiques sont refocalisés par les impulsions 180° sur les deux noyaux) et enfin de deux impulsions 90 simultanées sur les deux noyaux afin de transférer l’aimantation des spins I vers les spins S.

Figure 25 : Séquence d’impulsions HSQC utilisée, avec présaturation du signal de l’eau et l’utilisation de gradients, pour mettre en évidence les corrélations hétéronucléaires ¹H-¹³C permettant l’identification des composés. L’abréviation ad en indice de certaines impulsions indique que celle-ci est une adiabatique.

A la fin du transfert INEPT, l’aimantation est composée d’un terme en anti phase (2I_zS_y) et d’un terme en phase (I_y). Cependant seul le terme en anti phase nous intéresse puisque c’est celui qui a été transféré sur S et celui-ci se présente sous la forme :

Présaturation AQ TR HSQC 1H Gz 1H 90° 13C 13C t₁/2 t₁/2 τ τ τ τ Δ/2 Δ/2 Δ₁/2 Δ₁/2 Δ₂/2 Δ₂/2 90° 90° 90° 90° 90° 90° 90° 180° 180° 180° 180° 180_ad° 180_ad° 180_ad° 180_ad° G1 G2 Découplage

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S’en suit une période d’évolution permettant l’incrémentation de t1 (dimension indirecte) qui correspond à un écho de spin où les couplages sont refocalisés et où l’aimantation évolue sous l’influence des déplacements chimiques de S (l’impulsion 180° sur I refocalisant les déplacements protons). Seul le terme qui a été transféré sur S nous intéresse et à l’issu de la période d’évolution l’aimantation est décrite par :

La suppression des signaux non désirés se fait par l’application de gradient de champ pulsés (g-HSQC¹⁴³) et les meilleurs résultats sont obtenus lorsque le premier gradient est appliqué pendant la période d’évolution de l’hétéronoyau et le second juste avant la période de détection¹⁴⁴ conduisant à la formation d’un écho de gradient hétéronucléaire ce qui est le cas de la séquence que nous avons utilisé. Les deux impulsions 90° simultanées sur les deux noyaux permettent de re-transférer l’aimantation sur les spins I en vue de leur détection. Ce transfert transforme le terme en qui est une aimantation en antiphase sur le spin I et le terme en qui est une cohérence multi-quantum non observable. Il est impossible d’appliquer un découplage à un terme en antiphase puisque cela conduirait à la suppression du multiplet. Un écho de spin est alors appliqué afin de transformer le terme en antiphase en terme en phase afin de pouvoir appliquer un découplage pendant l’acquisition. A la fin de l’écho de spin, le terme en antiphase est devenu un terme en phase :

Si le signal est observé sous découplage des noyaux S, seul le terme contribue et conduit ainsi à un pic à la fréquence dans la dimension ω₂ et à la fréquence dans la dimension ω1 ce qui correspond au pic de corrélation. L’intensité de ce pic est maximale lorsque Δ vaut

puisque celle-ci dépend d’un facteur . De la même façon il est facile de démontrer que la valeur optimale pour Δ1 est

.

La dernière partie de la séquence est un schéma proposé par Schleucher et al¹⁴⁵ engendrant une amélioration de la sensibilité qui dépend des valeurs fixées pour les différents délais et dont les facteurs de gains varie en fonction du groupement (CH, CH2 ou CH3). Généralement, c’est la sensibilité des CH qui est la plus critique et les délais sont fixés de telle sorte que le gain soit maximum pour ces groupements et, dans ce cas, leur intensité est augmentée de 50 % contre 20 à 30 % pour les CH2 et CH3.

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Les paramètres utilisés lors de l’acquisition des spectres HSQC sur le caviar et en HR-MAS sont donnés en Tableau 5.

Paramètres d'acquisition HSQC ¹

H-13

C HR-MAS Liquide

Mode d'acquisition en F1 Echo-Anti Echo Echo-Anti Echo

Echantillonnage F2 2048 2048 Nombre d'incréments 256 512 Temps de l'incrément (µs) 3 3 Fenêtre spectrale 1H (ppm) 13,5 13,5 Fenêtre spectrale 13C (ppm) 180 180 Temps d'acquisition F2 (s) 0,4 0,13 Gain du receveur 128 128 Délai de relaxation (s) 1,5 2 Temps de l'incrément (µs) 150 150

Nombre de scans fictifs 128 32

Nombre de scans 256 32

Durée impulsion 1H 90° (µs) 5,9 13

Découplage GARP-4 bi_p5m4sp_4sp (adiabatique)

Constante J(CH) en Hz 145 145

Tableau 5 : Paramètres d’acquisition HSQC ¹H-¹³C utilisés pour l’identification des composés présents dans les échantillons de poisson (HR-MAS) et de la phase aqueuse du caviar (Liquide)

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