3.2 Composés à luminescence persistante rouge/infrarouge
4.1.1 Injection sous-cutanée
Limite de détection
Nous avons conduit des expériences visant à déterminer la quantité minimale de particules détectables en injections sous-cutanées. Ces expériences sont naturellement dépendantes de la quantité de lumière émise par les nanoparticules mais aussi de l’ani- mal à imager.
Une suspension de nanoparticules a ainsi été injectée en sous-cutané dans le dos d’une souris Swiss non rasée. Pour l’excitation avant injection, les nanoparticules en suspension ont été exposées directement à une lampe UV de 6 Watt pendant 5 min à une distance de 2 cm. Afin de tester la plus faible dose détectable, 20 µL de suspensions à différentes concentrations de nanoparticules (100, 10, 1 µg/mL) ont été injectées à trois endroits différents du dos de la souris (voir Figure 4.1). L’acquisition est faite juste après injection pendant 2 min.
Les deux doses les plus importantes (correspondant respectivement à 2 µ g et 200 ng de nanoparticules) sont facilement détectables. La dose administrée la plus faible (20 ng) a également donné un signal détectable avec un rapport signal sur bruit satisfaisant car supérieur à 5. L’analyse du signal est donné en Figure 4.2. Le rapport signal sur bruit se calcule comme le rapport entre le signal et la variance du bruit1. Un traitement
1
4.1 : Injections locales 101
Fig. 4.1: Image de l’injection de nanoparticules à luminescence persistante en sous-cutané. Les différents points d’injections sont marquées par une flèche blanche. Les quantités injectées sont de 2 µg, 200 ng et 20 ng en allant de gauche à droite.
de l’image en utilisant un filtre médian2 permet d’identifier clairement la position de
l’injection.
On note l’importante diffusion de la lumière autour du point d’injection. Ceci n’est pas dû à une diffusion des particules sous la peau, celles-ci étant injectées localement, mais bien à la diffusion de la lumière à travers les tissus. On voit ainsi l’importance de ce phénomène, même à des très faibles profondeurs.
Comparaison avec d’autres fluorophores
La difficulté à comparer les différentes méthodes en optique vient du fait que dans certains cas on parle de molécules, de protéines ou encore de nanoparticules. Générale- ment, l’unité qui prévaut est la mole.
Cette unité, qui a été développée pour les molécules, est mal adaptée lorsqu’il s’agit de particules. Si on prend l’exemple des quantum dots , un QD composé de CdSe/ZnS de taille 1,9 nm émettant à 490 nm a une masse molaire de 3 µg/nmol tandis que pour une taille de 5,2 nm, correspondant à une émission à 620 nm, la masse molaire est de 200
µg/nmol (données techniques disponibles sur le site http ://www.evidenttech.com/).
Cela correspond donc respectivement à 3.103 et 200.103 g/mol en comparaison de 332
g/mol pour la fluorescéine.
Pour pousser la comparaison jusqu’au bout, la masse molaire des particules que nous avons synthétisées est d’environ 6000 kDa3. Ainsi pour l’injection de 20 ng de
particules correspond à 3,2.10−16mol (2 × 108 particules) soit 0,32 pmol !.
La comparaison entre différentes expériences faites dans les laboratoires est donc
2Le filtre médian est un filtre spatial qui calcule en chaque pixel la médiane des niveaux de gris des pixels de son entourage. En utilisant ce type de filtre, il est possible d’enlever le bruit dit "impulsif" correspondant au bruit lié au détecteur de la caméra et ainsi de faire ressortir les petits signaux.
3Les nanoparticules ayant une phase cristalline proche de la clinoenstatite, nous avons calculé la masse d’une particule en prenant ce paramètre de maille. On obtient alors qu’une particule sphérique de 50nm de diamètre contient ≈ 7,8 × 104mailles. Le calcul donne alors une masse de 1,05× 10−16g par particules soit un poids moléculaire de 6,3 × 107g/mol
102 Partie II : Détection in vivo de particules non modifiées 1 10 0 100 200 300 400 500 600 Pixel In te n si té (u .a .) (A) (B) (C) 100 1000 Bruit de fond 20 ng 200 ng 2µg axe d'analyse max : 9.8E4 7.5E4 5.0E4 2.5E4 0
Fig. 4.2: Limite de détection en injection sous-cutanée (A) Image en fausse couleur du signal obtenu (B) Application d’un filtre médian 7 pixel sur l’image du signal. La zone d’injection de la plus faible dose est alors clairement identifiable. Le traitement d’image a été réalisé avec le logiciel ImageJ du NIH (http ://rsb.info.nih.gov/ij/)(C) Analyse du signal selon l’axe décrit sur l’image (A). Par cette analyse, il est possible d’obtenir le rapport signal sur bruit pour chaque dose. (unité :ph/s/sr/cm2)
difficile. De plus, le matériel de détection, les rampes lumineuses d’excitation ou encore le type de souris n’est pas le même. Pour donner tout de même un ordre de grandeur, en injection sous-cutanée, de 1 à 4 ng de QDs (5-10 pmol) sont utilisés pour obtenir un fort signal [22, 117]. En bioluminescence, il est possible de détecter environ 104 cellules
exprimant la luciférase.
Souris utilisées en imagerie optique Comme il a été dit, les expériences ont été
réalisées sur des souris Swiss non rasées. En imagerie optique, l’espèce de souris la plus fréquemment utilisée est la souris nude pour plusieurs raisons. Immunodéficiente, il est possible de travailler sur des modèles humains de tumeur. Du point de vue de l’imagerie optique, elle présente l’avantage d’avoir une peau fine pauvre en mélanine, facilitant ainsi la pénétration de la lumière (nous verrons dans le chapitre consacré à la détection de tumeur, l’effet de la mélanine sur le signal). Elle ne possède également pas de poils. Les poils (quand ils sont blancs) présentent une forte réflexion, rendant les expériences en fluorescence difficiles. La technique développée permet de s’affranchir de la réflexion de lumière par les poils en travaillant comme s’il s’agissait de bioluminescence.