0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 0 200 400 600 800 1000 1200 Amino-NPs Carboxy-NPs PEG-NPs Carboxy-NPs + lipo PEG-NPs + lipo Temps (s) In tensit é (u .a.) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 R O I_ 1 R O I_ 2 1- 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Temps (s) (A) (B)
Fig. 6.10: (A) Intensité totale retrouvée en définissant une ROI couvant l’ensemble de l’animal selon la particule injectée (B) Rapport entre les intensités provenant d’une région d’intérêt couvrant poumons, foie et rate et l’intensité totale détectée sur l’ensemble de l’animal. Ce rapport permet d’estimer la quantité de particules captées par l’ensemble poumons-foie-rate et donc la quantité de particules circulantes
6.2 Détection de tumeurs
Avant d’envisager des expériences de ciblage, nous voulions savoir si les nanoparti- cules étaient capables de révéler l’emplacement d’une tumeur implantée chez une souris. Le rationnel de cette approche est basé sur deux hypothèses.
La première provient du fait que la plupart des tumeurs sont des zones hypervascu- larisées. Lors des expériences utilisant les particules PEGylées, nous avons pu visualiser les principales artères de la souris (artères fémorales et artères irriguant le cerveau).
La deuxième hypothèse sur laquelle nous comptions pour visualiser la tumeur était l’effet de ciblage passif [143, 144]. De nombreux auteurs ont en effet montré qu’il était possible de cibler une tumeur sans avoir recourt à des motifs de reconnaissance. Le sys- tème vasculaire d’une tumeur est en effet souvent chaotique et peut avoir des "fuites". Les particules pouvant rester de façon prolongée dans la circulation auraient ainsi ten- dance à s’extravaser au niveau des ruptures de l’endothélium vasculaire et ainsi rester bloquer dans la tumeur.
Deux types de tumeurs ont été utilisées : une tumeur issue d’un carcinome pul- monaire de Lewis (3LL) et une tumeur de type mélanome B16. Pour augmenter nos chances de réussite, nous nous sommes placés dans les conditions expérimentales qui avaient permis le temps de circulation des nanoparticules le plus important. C’est pour- quoi nous avons réalisé une préinjection de liposomes anioniques (6 µmol, 100 µL) 5 min avant l’injection de particules PEGylées.
Lors de cette expérience, nous avons partiellement rasé la souris afin d’éviter l’ab- sorption de lumière par les poils de la souris. Sans cela, le signal serait à peine détectable. Malgré l’absence de poil, la présence de mélanine a engendré une forte diminution du
138 Partie III : Expériences in vivo
signal détecté en comparaison de celui détecté dans les expériences sur souris Swiss (voir Figure 6.11). Ainsi, même si les souris C57Bl/6 sont généralement de taille plus petite, la présence de mélanine abaisse le signal d’un facteur 5 à 10, ce qui réduit d’autant la durée possible de suivi des particules in vivo.
1000 10000 100000 0 200 400 600 800 1000 1200 Time (s) In ten si ty (a.u. ) Souris Swiss Souris C57Bl/6
Fig. 6.11: Intensité lumineuse récupérée après injection intraveineuse de nanoparticules dans deux types de souris (souris Swiss, souris C57Bl/6)
6.2.1 Tumeurs 3LL
Les tumeurs 3LL (ou LLC) sont un modèle tumoral largement utilisé pour étudier des traitements anticancéreux. Il s’agit d’une lignée cellulaire issue d’un carcinome pul- monaire spontané de souris C57Bl/6 découverte par Dr. M. Lewis en 1951. La tumeur est relativement homogène et solide avec une importante vascularisation extrêmement hémorragique. Ces tumeurs ont été implantées en sous-cutané dans le flanc de souris fe- melles C57Bl/6 de 5 semaines. L’implantation d’un fragment de tumeurs se fait à l’aide d’un trocart. De 10 à 14 jours après l’implantation, nous avons réalisé les expériences de biodistribution. Les tumeurs étaient relativement importantes avec des tailles de l’ordre du cm. La visualisation de l’emplacement de la tumeur était donc clairement identifiable à l’oeil.
Après injection intraveineuse de particules PEGylées après préinjection de liposomes anioniques, nous avons observé une augmentation du signal au niveau de la tumeur, ce qui permet de distinguer clairement le contour de la tumeur (voir Figure 6.12). La visualisation de la tumeur n’est pas pénalisée par la présence proche de l’artère fémorale qui engendre elle aussi un fort signal et ce malgré la diffusion de la lumière dans les tissus.
Nous n’avons pas observé un ciblage passif important pour cette expérience. Comme nous avons pu le voir en microscopie en réitérant l’expérience avec des particules pos- sèdant du FITC en surface, très peu de particules sont détectables sur coupes (voir Figure 6.13). Ceci peut s’expliquer par l’élimination extrêmement rapide des particules en comparaison des expériences faites sur des souris Swiss. Il a été montré que les mécanismes d’élimination par le système réticulo-endothélial pouvaient varier selon les
6.2 : Détection de tumeurs 139 max : 1.23E5 8.0E4 6.0E4 4.0E4 0 max : 1.9E4 1.5E4 1.0E4 5.0E3 0 max : 1.1E4 8.0E3 6.0E3 4.0E3 0
(0-2 min) (8-10 min) (18-20 min)
Fig. 6.12: Visualisation de l’hypervascularisation d’une tumeur 3LL implantée dans le flanc d’une souris C57Bl/6
espèces. Toutefois, une étude approfondie serait nécessaire pour mieux comprendre une telle différence entre les souris Swiss et les souris C57Bl/6.
6.2.2 Tumeurs B16
Les tumeurs B16 sont issues d’une lignée cellulaire de mélanome. Elles contiennent donc une importante quantité de mélanine, pigment absorbant fortement la lumière. De plus, en comparaison des tumeurs 3LL, les tumeurs B16 sont moins vascularisées.
L’expérience d’injection intraveineuse a été conduite de la même façon avec pré- injection de liposomes anioniques. Les résultats de cette expérience sont en revanche opposés. La tumeur n’est pas détectable. Toutefois, comme les tissus environnants ab- sorbent moins et sont également vascularisés, la tumeur est tout de même identifiable par une absence de signal. Il s’agit en quelque sorte d’un équivalent du contraste négatif qui est obtenu en IRM avec des agents T2.
140 Partie III : Expériences in vivo
(A) (B)
(C) (D)
Fig. 6.13: Microscopie optique d’une coupe de tumeur 3LL après injection des particules PEGylées. L’animal a été sacrifié 30 min après l’injection des particules. On notera la présence importante des particules au niveau du système sanguin. Nous n’avons pas observé d’extravasation des particules au niveau de la tumeur.
Fig. 6.14: Visualisation par contraste négatif d’une tumeur B16 implantée dans le flanc d’une souris C57Bl/6