1. Structure et fonction des télomères
a. Structure des télomères : le complexe shelterin
Les télomères constituent un complexe nucléoprotéique à l’extrémité des chromosomes linéaires. Il s’agit d’une structure spécialisée qui permet de protéger les séquences d’ADN plus interne d’une activation inappropriée de la voie de réparation des dommages à l’ADN, mais également de la perte de séquence qui s’opère à chaque cycle de réplication de l’ADN. La séquence d’ADN télomérique des eucaryotes est constituée de répétitions en tandem de séquences télomériques riches en Guanine, ces séquences étant très conservées entre des espèces phylogénétiquement proches. En particulier, chez les vertébrés, l’ADN télomérique est constitué de la séquence hexanucléotidique 5’-TTAGGG-3’ (Meyne et al., 1989; Moyzis et al., 1988). Les télomères sont également constitués de six protéines (TRF1, TRF2 et POT1, TIN2, TPP1 et RAP1), l’ensemble de ces protéines et de l’ADN télomérique forment ainsi le complexe shelterin (Figure 18a) (pour revue Jafri et al., 2016).
Chez l’homme, la séquence télomérique est répétée en tandem sur environ 10 à 15kb à la naissance, donnant lieu à un brin riche en G et l’autre riche en C. Le brin riche en G est prolongé en 3’, constituant un simple brin de 150 à 200 nucléotides de long (Makarov et al., 1997). L’extrémité 3’ simple brin peut se replier et envahir la région homologue TTAGG double brin, formant une boucle télomérique (t-loop) (Figure 18b). La t-loop, en séquestrant l’extrémité 3’ de l’ADN télomérique fournit une protection contre la reconnaissance de l’extrémité par la machinerie de la réparation des DSB et empêche ainsi l’activation de la
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voie de DDR qui conduirait à fusionner deux extrémités de chromosomes différents (Doksani et al., 2013; Griffith et al., 1999).
Figure 18 : Structure des télomères (le complexe shelterin)
L’ADN télomérique est composé de séquences répétitives TTAGGG se terminant en un simple brin 3’. Les six protéines télomériques s’associent à ces séquences d’ADN pour former le complexe shelterin (a). Le simple brin en 3’ peut envahir la région double brin télomérique en créant une boucle télomérique (t-loop) et une boucle de déplacement (D-loop) au niveau du site d’invasion (b) (Deng et al., 2008).
Les protéines télomériques TRF1 et TRF2 reconnaissent directement les duplex répétés d’ADN TTAGGG et s’y fixent (Lin et al., 2014). Ils ont des rôles importants dans l’architecture du télomère, régulant la taille de ces derniers (Smogorzewska et al., 2000), et TRF2 est également impliqué dans la formation de la t-loop (Doksani et al., 2013). TIN2 joue un rôle dans la connexion et la stabilisation des protéines TRF1 et TRF2 au niveau des télomères (Ye et al., 2004). RAP1 interagit directement avec TRF2 et ce complexe joue un rôle dans la régulation de la taille des télomères grâce au recrutement de protéines de la réparation des DSB par RPA1 (en particulier les complexes MRN et Ku70/80) (O’Connor et al., 2004).
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La protéine POT1 est recruté au niveau du simple brin TTAGGG grâce à son interaction avec TPP1 et contribue aussi à la régulation de la taille des télomères (Liu et al., 2004).
b. Protection des extrémités chromosomiques de l’activation de la voie des DDR
Les protéines du complexe shelterin, en plus de jouer un rôle dans la structure et le contrôle de la taille des télomères, ont également un rôle prépondérant dans l’inhibition des mécanismes de réparation des DSB. En effet, l’extrémité télomérique peut être reconnue comme cassure double-brin et activer la voie des DDR. L’activation de ces mécanismes entraîne la fusion des extrémités des chromosomes, conduisant à une instabilité génomique et favorisant ainsi la tumorigénèse (pour revue Arnoult et al., 2017). Il a ainsi été montré que TRF2 est capable d’empêcher l’activation d’ATM (Karlseder et al., 1999), notamment grâce à la formation de la t-loop qui empêche la reconnaissance d’un DSB. Mais TRF2 est également capable d’inhiber la voie de signalisation en aval d’ATM (Okamoto et al., 2013) et la réparation des DSB par NHEJ (Ribes-Zamora et al., 2013). De plus le complexe TPP1-POT1 est responsable de l’exclusion de RPA au niveau du simple-brin télomérique en 3’, empêchant ainsi l’activation d’ATR (Gong and de Lange, 2010).
Une dysfonction télomérique peut se produire lorsque la structure du complexe shelterin est perturbée. Elle conduit à l’activation des voies de réparation des dommages à l’ADN, et au recrutement de nombreuses protéines impliquées dans la réparation au niveau des télomères. On note notamment l’apparition de foci de γH2AX, MDC1, NBS1, RNF8, RNF168, 53BP1 au niveau des télomères appelés alors TIF (Telomere dysfunction-Induced Foci) (Takai et al., 2003).
De façon physiologique, la dysfonction télomérique et la formation de TIF ont été observées au cours de la sénescence réplicative lorsque les télomères deviennent trop courts pour que la t-loop se forme (d’Adda di Fagagna et al., 2003). L’absence de formation de la t-loop conduit à un recrutement d’ATM au niveau du télomère qui est capable de phosphoryler ses cibles et notamment γH2AX, permettant le recrutement des protéines du TIF. En revanche, la présence de TRF2, même en faible quantité est toujours capable d’inhiber la fusion des extrémités des chromosomes par NHEJ, et permettant ainsi l’arrêt des cellules en
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sénescence sans que le génome ne soit déstabilisé par des fusions de télomères (Cesare et al., 2013).
La dysfonction télomérique et la formation des TIF peuvent également être provoquées par des délétions des protéines du complexe shelterin, alors que les télomères sont toujours longs. En particulier il a été observé que la formation des TIF suite à une délétion de TRF2 est dépendante de l’activation d’ATM, et causant une fusion des extrémités télomériques. Et suite à une délétion de POT1, la formation de TIF est dépendante de l’activation d’ATR (Denchi and de Lange, 2007).
2. Ciblage de la télomérase par les LG4 en thérapie anti-cancéreuse
La télomérase est l’enzyme responsable de l’élongation des télomères et de l’immortalisation des cellules cancéreuses (Bodnar et al., 1998). Elle a premièrement été identifié chez l’organisme cilié Tetrahymena (Greider and Blackburn, 1985). Il s’agit d’un complexe ribonucléoprotéique à activité réverse-transcriptase (Lingner et al., 1997). Chez l’homme, elle est constituée de la sous-unité catalytique hTERT (human telomerase reverse
transcriptase) et de l’ARN hTR (human telomerase RNA) (Feng et al., 1995; Nakamura et al.,
1997). L’ARN hTR contient des séquences complémentaires d’une ou plusieurs copies de la région télomérique répétée et agit comme un modèle pour la synthèse de l’ADN télomérique par hTERT. Le recrutement de la télomérase au niveau des télomères se fait notamment grâce à une interaction avec les protéines du complexe shelterin TPP1 (interaction directe) et TRF2 (interaction indirecte via la protéine SRSF11) (Lee et al., 2015; Xin et al., 2007).
La télomérase est surexprimée ou réactivée dans 90% des cancers. Un des mécanismes responsable de sa surexpression est l’apparition de mutations dans le promoteur du gène d’hTERT. En effet, des mutations très récurrentes sont souvent observées dans divers types de cancer, dont les cancers de la vessie, les mélanomes, ou encore les gliomes (Allory et al., 2014; Horn et al., 2013; Killela et al., 2013). Ces mutations conduisent au recrutement du facteur de transcription GABP spécifiquement au niveau du promoteur muté d’hTERT responsable de l’activation de son expression (Bell et al., 2015).
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Alors qu’elle est surexprimée dans la majorité des cancers, la télomérase est très peu active dans les cellules somatiques normales (Kim et al., 1994; Shay and Bacchetti, 1997). En revanche, les cellules souches hématopoïétiques, de la lignée germinale ou des tissus à renouvellement rapide (comme l’épiderme ou le tissus intestinal) présentent une activation de la télomérase. Mais ces cellules possèdent en général des télomères plus longs que les cellules cancéreuses, et leur taux de prolifération est plus faible (Masutomi et al., 2003; Wright et al., 1996). Ces caractéristiques ont fait de la télomérase une cible très intéressante en thérapie anti-cancéreuse, avec un risque minimum pour le raccourcissement des télomères dans des cellules normales. De plus, il avait été montré que l’inhibition de la télomérase dans les cellules cancéreuses conduit à la mort des cellules tumorales (Hahn et al., 1999; Herbert et al., 1999; Zhang et al., 1999).
Ainsi, de nombreuses stratégies thérapeutiques anti-télomérasique se sont développées. En particulier des oligonucléotides de séquence complémentaire de l’ARN hTR qui joue donc un rôle d’inhibiteur compétitif (Dikmen et al., 2005; Marian et al., 2010), ou encore l’immunothérapie anti-télomérase grâce à la vaccination réalisée à partir de peptides de la télomérase (Kyte, 2009).
Parmi les stratégies d’inhibition de l’activité de la télomérase, il a été envisagé d’exploiter la capacité des télomères à former des structures G4. En effet, il a été montré, in vitro, que la formation de ces structures G4 (stabilisés par des cations monovalents) à partir de séquences télomériques conduit à l’inhibition de l’élongation de ces séquences par la télomérase (Zahler et al., 1991). La formation des structures G4 se ferait au niveau du simple brin 3’, or c’est ce simple brin qui sert de substrat pour l’élongation par la télomérase. Ainsi la structure G4 inhibe l’activité d’élongation de la télomérase en empêchant l’accès à son substrat. La recherche de molécules capable d’interagir et de stabiliser les structures G4 (appelés ligands G4, LG4) au niveau des télomères et d’inhiber l’activité de la télomérase a été très intense. Il a effectivement été observé que ces LG4 peuvent aussi inhiber l’élongation des séquences télomériques par la télomérase in vitro (Fedoroff et al., 1998; Sun et al., 1997). Enfin, il a également été montré in cellulo que les LG4 peuvent réduire la taille des télomères dans les cellules cancéreuses (Riou et al., 2002). Ces études suggèrent donc
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que les LG4, par leur effet inhibiteur de l’activité de la télomérase, ont un potentiel intéressant dans le cadre d’une thérapeutique anti-cancéreuse.