Autres effets anti-cancéreux potentiels

Outre la formation des structures G4 dans les promoteurs des gènes, il a également été décrit que des structures G4 se forment au niveau de l’ADNr (gène codant pour l’ARN ribosomique, constituant essentiel des ribosomes). Il s’agit d’une séquence d’ADN qui contient plus de 400 copies du gène de l’ARNr. Le brin qui ne sert pas de modèle pour la transcription est riche en guanine et capable de former une structure G4.

De plus, la nucléoline, protéine nucléolaire nécessaire pour la transcription de l’ADN ribosomique par l’ARN polymérase I, a été décrite pour interagir avec une très grande affinité pour la structure G4 formée par le brin non transcrit de l’ADNr (Hanakahi et al., 1999). Cette interaction de la nucléoline avec les structures G4 de l’ADNr peut être interrompue par l’action du LG4 Quarfloxine (ou CX-3543), par des effets d’interaction compétitive avec cette structure G4. La nucléoline est alors relocalisée dans le nucléoplasme, conduisant à une inhibition de la transcription de l’ADNr par l’ARN polymérase I et à l’activation d’une réponse apoptotique dans les cellules cancéreuses (Drygin et al., 2009).

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Enfin, il a été montré qu’à la suite d’un traitement avec la Quarfloxine, la nucléoline en se retrouvant dans le nucléoplasme interagit et stabilise le G4 dans le promoteur de c-Myc et conduit à une inhibition de l’expression de c-Myc (González et al., 2009). Tous ces mécanismes d’action participent à l’efficacité anti-cancéreuse de la Quarfloxine. Cette molécule est d’ailleurs la première et la seule parmi la classe de molécules qui stabilisent les structures G4 à être entrée en essais clinique. Elle est parvenue jusqu’en phase II pour le traitement de tumeurs neuroendocrine/carcinoïde, mais a été abandonnée à cause de problèmes de biodisponibilité (Balasubramanian et al., 2011).

Les études computationnelles ont révélé l’existence de PG4 en particulier dans les régions 5’-UTR des ARNm. De plus, l’utilisation d’anticorps anti-G4 (Biffi et al., 2014), ou de certains LG4 fluorescents (Cogoi et al., 2013; Hampel et al., 2013) ont montré un marquage nucléaire mais aussi extra-nucléaire, suggérant donc que des structures G4 peuvent effectivement se former dans des acides nucléiques cytoplasmiques tels que les ARNm. Il a notamment été montré que l’ARNm de certains oncogènes tels que KRAS ou BCL-2, présentent un PG4 dans leur 5’-UTR qui est capable de former une structure G4 in vitro (Faudale et al., 2012; Shahid et al., 2010). En particulier, la stabilisation de la structure G4 de KRAS par le LG4 TMPyP4- C14 conduit à une inhibition de la traduction de cet ARNm (Faudale et al., 2012).

De plus, de récentes études proposent que les structures G4 pourraient également se former dans les mitochondries. En effet, des études de bioinformatique ont identifié des séquences PG4 dans le génome mitochondrial (Bedrat et al., 2016). La formation de ces structures dans l’ADN mitochondrial pourrait jouer un rôle dans la réplication et la stabilité du génome mitochondrial (Bharti et al., 2014; Wanrooij et al., 2010).

Le ciblage de ces structures G4 de l’ADN mitochondriale semble intéressant en thérapie anti- cancéreuse puisqu’il a été montré qu’un LG4 fluorescent, le BMVC, se localise préférentiellement dans les mitochondries des cellules cancéreuses et induit la mort de ces cellules en supprimant l’expression des gènes mitochondriaux. De plus, les auteurs ont montré que la sélectivité vis-à-vis des cellules normales est basée sur le fait que dans les cellules normales le BMVC se localise plutôt au niveau lysosomal, et constitue un mécanisme de résistance puisque le BMVC ne peut alors pas cibler les G4 mitochondriaux (Huang et al., 2015; Kang et al., 2013).

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Objectifs de la Thèse

Le traitement des cancers par la chimiothérapie est en général limité par la toxicité et la mise en place de mécanismes de résistance par les cellules cancéreuses. De nombreuses études soulignent le besoin de nouveaux composés qui agissent via des modes d’action différents ou complémentaires de ceux des chimiothérapies actuelles.

L’ensemble des études réalisées sur les LG4 montrent un potentiel intéressant pour atteindre de nombreuses cibles oncogéniques, une capacité à induire la sénescence et la mort cellulaire, et une sélectivité vis-à-vis des cellules cancéreuses. Ces données suggèrent donc que les LG4 sont d’un intérêt particulier pour le développement en thérapie anti- cancéreuse. De nombreux LG4 ont déjà été synthétisés et de nombreuses études restent encore à mener sur ces molécules afin de comprendre leurs mécanismes d’action et de pouvoir exploiter au mieux leurs effets anti-cancéreux.

Nous avons travaillé sur le ligand G-quadruplexe 20A, correspondant au composé n°3 de l’article suivant (Smith et al., 2011). Parmi la série de LG4 qui a été synthétisée dans cette étude, le 20A a été sélectionné pour sa capacité importante à stabiliser les structures d’ADN G-quadruplexe in vitro. Il présente aussi l’avantage d’avoir une bonne affinité et sélectivité pour ces structures par rapport à des duplexes d’ADN. Le 20A présente également une des IC50 les plus faibles sur la lignée de cellules cancéreuses HeLa par rapport aux autres

composés, et dans des délais courts (24h de traitement), suggérant que les effets du 20A ne font pas intervenir d’effets au niveau des télomères et de la télomérase.

De plus, des résultats non publiés de travaux réalisés dans le laboratoire du Dr Jean-Louis Mergny ont étudié la sensibilité de cellules transformées par rapport à des cellules non transformées de différents LG4 (dont la pyridostatine, Braco-19 ou le 360A). Cette étude a révélé que le 20A est l’un des LG4 auquel les cellules transformées sont les plus sensibles, avec une IC50 4 fois plus importante que pour les cellules non transformées.

L’ensemble de ces résultats préliminaires suggéraient donc que le 20A serait un LG4 intéressant pour des études plus poussées, qui permettraient de comprendre ses mécanismes d’action et d’évaluer son potentiel thérapeutique anti-cancéreux.

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Ainsi, les objectifs généraux de ma thèse ont consisté à :

- Etudier les réponses cellulaires associées à la perte de viabilité rapide des cellules cancéreuses en réponse à 24h de traitement au 20A, à des doses non létales pour les cellules normales (celle-ci étant supérieure à 10µM)

- Evaluer les conditions dans lesquelles le 20A serait le plus efficace afin de déterminer les contextes cancéreux qui seraient les plus sensibles au 20A

Nous avons donc évalué la sénescence et l’apoptose, qui sont des réponses cellulaires responsables de la perte de viabilité en réponse à des agents anti-cancéreux. Afin d’orienter nos études moléculaires pour la compréhension des mécanismes impliqués dans ces réponses, nous avons réalisé des études de transcriptomique et de protéomique qui nous ont permis d’identifier qu’en réponse au 20A, les cellules présentent une augmentation de l’expression de gènes impliqués dans les voies de réponse des dommages à l’ADN, ainsi que des voies de signalisation des fonctions lysosomales (en particulier de l’autophagie).

Au cours des expériences que nous avons réalisées, nous avons également remarqué deux caractéristiques frappantes qui sont d’une part que le 20A est fluorescent et se retrouve localisé au niveau des lysosomes, et que les cellules traitées au 20A présentent une proportion importante de cellules à double noyaux.

Nous avons alors définis trois objectifs spécifiques :

- Vérifier l’activation des voies de DDR et de l’autophagie, et déterminer leur rôle dans et la sénescence et la mort cellulaire induite par le 20A.

- Déterminer les conséquences de la localisation lysosomale du 20A dans les réponses cellulaires au 20A.

- Etudier les mécanismes de formation des cellules binucléées et leur rôle dans la réponse au traitement par le 20A

La partie résultat de ce manuscrit est donc séparée en trois sous-parties afin de présenter chacun de ces objectifs. Ce travail a fait l’objet d’un premier article qui a été soumis au journal Nucleic Acid Research et est en cours de révision actuellement. Un second article est en cours de préparation et nécessite quelques expériences supplémentaires avant soumission. Enfin, la troisième partie des résultats est présentée sous forme de résultats complémentaires.

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La partie « Matériels et méthodes » relative aux deux premiers articles est présentée dans chaque article respectif (des pages 148 à 154 pour l’article n°1 ; 188 à 193 pour l’article n°2). Suite à la réponse des referees concernant le premier article, de nombreuses études supplémentaires ont été demandées. Trois de ces expériences seront présentées dans ce manuscrit, et les matériels et méthodes concernant ces expériences sont indiqués en I) de cette partie.

Les « Matériels et méthodes » relatifs aux résultats complémentaires de la partie n°3 sont présentés en II) de cette partie.

I)

Matériels et méthodes supplémentaires (article n°1)

A. Immunohistochemistry

for

apoptosis

and

senescence

assessment on paraffin embedded tumor bloc

At the day of the sacrifice, tumor blocks were fixed in 4% formol and paraffin embedded for hematoxylin-eosin-saffron staining and immunohistochemical labeling of apoptosis marker Cleaved-Caspase3, or the Sudan-Black-B (senescence marker that stain for lipofuscin) as described in (Evangelou and Gorgoulis, 2017). High-quality images were made with slide scanner Nanozoomer (Hamamatsu) in the Bordeaux Imaging Center. Tumor morphology and immunohistochemical staining were analyzed by a pathologist.