Influence du taux de remplissage en configuration boucl´ ee 131

Os 291 fungos foram cultivados em placa de Petri (90 x 15 mm) contendo meio Potato Glucose Agar (Sigma-Aldrich), com 50 µg/mL de penicilina. Após o crescimento, fragmentos de micélio foram coletados e transferidos para tubos do tipo Falcon de 50 mL, contendo 15 mL de meio de cultura PDB (Potato Dextrose Broth, Sigma-Aldrich). Os fungos foram incubados a 28°C sob agitação (200 rpm) por até 10 dias. Após o cultivo, o micélio foi

coletado com auxílio de uma espátula esterilizada e transferido para uma folha de papel filtro esterilizado (Papel Filtro Qualitativo 80 g 150 mm, Unifil). O micélio seco foi embrulhado em folhas de papel alumínio esterilizado e armazenado em freezer (-20°C).

A maceração foi realizada com nitrogênio líquido até apresentar aspecto de um pó fino e em seguida esse material foi submetido à extração de ácidos nucléicos conforme a metodologia de RAEDER & BRODA (1985), com modificações. As modificações consistiram na realização de um número maior de lavagens com os solventes fenol e clorofórmio (duas a três lavagens ao invés de uma) e no tratamento com RNAse, que era a última etapa e passou a ser realizada após a incubação do macerado a 65°C no tampão de extração. A quantificação e a qualidade dos ácidos nucléicos foram avaliadas tanto por análise em espectrofotômetro NanoDrop™ 1000 (Thermo Fisher Scientific), quanto por análise em gel de agarose 1%, em comparação com DNA de bacteriófago lambda com concentrações conhecidas (25, 50, 75 e 100 ng/L). O gel de agarose foi fotodocumentado sob luz UV e o ácido nucléico foi preservado em freezer (-20°C).

3.2.2.2. Amplificação por PCR da região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico e de outros genes, purificação dos produtos e sequenciamento

O DNA genômico extraído de cada uma das 291cepas foi utilizado como molde em reações de PCR para amplificação da região ITS1-5,8S-ITS2 do DNA ribossômico com os primers ITS1-F (GARDES & BRUNS, 1993) e ITS-4 (WHITE et al., 1990), os quais amplificam um fragmento de aproximadamente 570-600 pares de bases (pb). As reações de amplificação da região ITS1-5,8S-ITS2 foram preparadas em volume de 50 L contendo 0,2 mM de dNTPs; 3,7 mM de MgCl2; tampão 1X Colorless GoTaq® Flexi Buffer pH 8,5 (Promega); 1,5 Unidades de GoTaq® G2 Hot Start Polymerase (Promega); 0,8 µM de cada primer e 20 ng de DNA genômico. A reação de PCR foi realizada em termociclador (Applied Biosystems) nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94°C por 4 min, seguida de 30 ciclos de amplificação (desnaturação a 94°C por 30 seg, anelamento a 55°C por 30 seg, extensão a 72°C por 30 seg) e extensão final a 72°C por 10 min.

Para os fungos selecionados para hidrólise enzimática (27 cepas), além da região ITS1-5,8S-ITS2, outros marcadores foram amplificados por PCR: β-tubulin; calmodulin; actin; e translation elongation factor 1 alpha (EF-1α). As condições de amplificação para cada um destes alvos é descrita a seguir.

A amplificação por PCR de uma região específica do gene β-tubulina foi realizada com os primers Bt2a e Bt2b (GLASS & DONALDSON, 1995), os quais amplificam um

fragmento de aproximadamente 350 pb. As reações de amplificação foram preparadas em volume de 50 L contendo 0,2 mM de dNTPs; 3,7 mM de MgCl2; tampão 1X Colorless GoTaq® Flexi Buffer pH 8,5 (Promega); 1,5 Unidades de GoTaq® G2 Hot Start Polymerase (Promega); 0,2 µM de cada primer e 20 ng de DNA genômico. A reação de PCR foi realizada em termociclador (Applied Biosystems) nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94°C por 4 min, seguida de 30 ciclos de amplificação (desnaturação a 94°C por 1 min, anelamento a 58°C por 1 min, extensão a 72°C por 1 min) e extensão final a 72°C por 10 min.

A amplificação por PCR do gene calmodulina foi realizada com os primers CMD5 e CMD6 (HONG et al., 2005), os quais amplificam um fragmento de aproximadamente 570 pb. As reações de PCR e as condições de amplificação foram semelhantes às descritas para o gene β-tubulina, exceto a temperatura de anelamento dos primers, que foi de 55°C, conforme indicado por SAMSON et al. (2014).

A amplificação por PCR do gene actina foi realizada com os primers ACT-512F e ACT-783R (CARBONE & KOHN, 1999), os quais amplificam um fragmento de aproximadamente 300 pb. As reações de amplificação foram preparadas em volume de 50 L contendo 0,2 mM de dNTPs; 2 mM de MgCl2; tampão 1X Colorless GoTaq® Flexi Buffer pH 8,5 (Promega); 1,5 Unidades de GoTaq® _{G2 Hot Start Polymerase (Promega); 0,5 µM de cada} primer e 20 ng de DNA genômico. A reação de PCR foi realizada em termociclador (Applied Biosystems) nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94°C por 4 min, seguida de 35 ciclos de amplificação (desnaturação a 95°C por 30 seg, anelamento a 61°C por 30 seg, extensão a 72°C por 1 min) e extensão final a 72°C por 10 min.

Para a amplificação do gene EF-1α (translation elongation fator 1 alpha) foram utilizados os primers EF1-728F e EF1-986R (CARBONE & KOHN, 1999), os quais amplificam um fragmento de aproximadamente 350 pb. As reações de PCR e as condições de amplificação foram semelhantes às descritas para o gene actina, exceto a temperatura de anelamento dos primers, que foi de 58°C.

Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1% com marcador de peso molecular de 1 Kb e fotodocumentados sob luz UV. Em seguida, os produtos de reação foram purificados com auxílio de Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), quantificados e sequenciados com os respectivos primers utilizados nas amplificações. O sequenciamento foi realizado para ambas as fitas (senso e antisenso) pela empresa Eurofins do Brasil (Indaiatuba, São Paulo).

3.2.2.3. Análise de sequências

As sequências foram analisadas com auxílio dos softwares Staden Package (STADEN et al., 2000) ou Geneious R11 (https://www.geneious.com) para verificação da qualidade e obtenção das sequências consenso. As sequências de boa qualidade foram analisadas com a ferramenta BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool) contra diferentes bases de dados: GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), Mycobank (http://www.mycobank.org/), e Ribosomal Database Project (https://rdp.cme.msu.edu/). No caso do GenBank, a análise foi realizada tanto na base de dados global quanto na base de dados “Sequences from type material”. Para o gênero Fusarium, também foi utilizada a base de dados Fusarium-ID

(http://isolate.fusariumdb.org/blast.php) (GEISER et al., 2004). Os resultados foram

apresentados em tabela e somente as sequências com 100% de identidade àquelas de linhagens tipo (type strains) foram classificadas ao nível de espécie. Para as cepas cuja única sequência obtida foi a da região ITS do rDNA, a classificação foi apresentada ao nível de gênero, exceto quando a identidade com sequência oriunda de type strain foi de 100%.