Influence de la température

Avec le PGC, l’influence de la température de la colonne sur la séparation est difficilement prévisible. Comme nous l’avons vu précédemment, l’évolution de la rétention des CDs natives sur PGC en fonction de la température dépend de la composition de la phase mobile [2, 3]. D’autres travaux ont montré que la rétention de disaccharides sulfatés augmente avec la température avec une phase mobile acide contenant 40% d’ACN mais diminue avec une phase mobile basique contenant 5% d’ACN [13]. Enfin, la rétention des carraghénanes n’est que peu modifiée par la température [17].

CHAPITRE 2 – Caractérisation de β-cyclodextrines sulfobutylées et méthylées

Références bibliographiques : p. 85 – 87. 53

isocratique avec une phase mobile H2O/ACN (83/17) contenant 30 mM de NH4CH3CO2. Le mélange analysé a été synthétisé au laboratoire en modifiant les conditions de réaction décrites dans le brevet de Stella et Rajewsky [25] de façon à n’obtenir que la SBE-β-CD monosubstituée (voir annexe I). La figure 2.3 montre les chromatogrammes obtenus à 30, 45, 60 et 75°C. Les pics des trois isomères sont désignés par les lettres A, B et C par ordre de rétention croissante et correspondent respectivement aux 3-O-SBE-β-CD, 6-O-SBE-β-CD et 2-O-SBE-β-CD [1]. Le mélange contient aussi une importante concentration de β-CD native n’ayant pas réagi lors de la réaction de substitution. Si l’on considère que les réponses de la β -CD native et des trois isomères sont équivalentes [22], on peut évaluer le rapport β -CD/SBE-β-CDs à 95/5. Les conditions de synthèse sont telles que seule une petite fraction de la β-CD est substituée. Les autres solutés détectés correspondent aux ions Na⁺, élués en volume mort et aux produits secondaires de la réaction tel que l’acide 4-hydroxybutane sulfonique.

Figure 2.3. Influence de la température de la colonne sur la séparation chromatographique des trois isomères de la SBE-β-CD monosubstituée.

Conditions : colonne Hypercarb (100 x 4,6 mm ; 5µm) ; phase mobile : H2O/ACN (83/17) + 30 mM de NH4CH3CO2 ; température de la colonne : 30, 45, 60 et 75°C ; débit : 1 mL/min ; détection : DEDL.

Ordre d’élution : A : 3-O-SBE-β-CD, B : 6-O-SBE-β-CD, C : 2-O-SBE-β-CD.

La figure 2.3 montre que la rétention des trois isomères de SBE-β-CD monosubstituée augmente avec la température de la colonne. Entre 30 et 75°C, les

β-CD A B C 30°C β-CD A B C 75°C β-CD A B C 60°C β-CD A B C 45°C

facteurs de rétention sont multipliés par 3. De même, comme attendu [2], la rétention de la β-CD native augmente mais plus faiblement que celle des SBE-β-CDs. Accroître la température de la colonne permet donc d’augmenter la sélectivité entre les pics des isomères et celui de la β-CD, présente en grande concentration dans le mélange injecté.

Afin d’apporter des éléments pour mieux interpréter cet effet de température plus marqué sur la rétention des SBE-β-CDs, le comportement chromatographique de l’ion sulfate sur PGC a été étudié entre 25 et 85°C avec une phase mobile H2O/ACN (80/20) contenant 10 mM de NH4CH3CO2. La rétention du dianion inorganique est constante et ne varie pas avec la température. Il semble donc que la différence de comportement chromatographique entre les trois isomères de SBE-β -CD et la β-CD native vis-à-vis de la température soit due plutôt à la partie alkyle du substituant qu’à sa charge ionique.

Par ailleurs, la solubilité des CDs dans une phase mobile principalement aqueuse augmente avec la température [23], ce qui pourrait provoquer une diminution de leur rétention. Or c’est l’effet inverse qui est observé. Cette augmentation de rétention pourrait s’expliquer en partie par une moins grande rigidité des CDs à haute température, ce qui leur permettrait d’augmenter leur surface de contact avec le PGC et donc leur rétention (paragraphe II.3.).

Le tracé du logarithme du facteur de rétention en fonction de l‘inverse de la température, ln k = f(1/T) (courbe de Van’t Hoff) montre une linéarité satisfaisante (r²>0.96) et des pentes de l’ordre de –3000 pour les trois isomères. Pour la β-CD native, cette pente est de l’ordre de –2200, montrant que sa rétention est moins influencée par la température que celle des isomères. La pente étant égale à -∆H/R, on en déduit que ∆H (enthalpie de transfert du soluté de la phase mobile vers la phase stationnaire) est positif, autrement dit, le processus de transfert de la β-CD (∆H = 18,3 kJ/mol) et des trois isomères (∆H = 25 kJ/mol) de la phase mobile vers la phase stationnaire est endothermique. Ces valeurs d’enthalpie sont du même ordre de grandeur que celle rencontrées lorsque l’effet de la température est inverse (rétention diminuée).

Entre 30 et 75°C, la sélectivité entre les isomères est faiblement affectée par l’augmentation de température de la colonne puisque le facteur de séparation α entre

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bénéfique sur l‘efficacité de la séparation puisque celle-ci augmente pour les trois dérivés passant d’environ 900 à 3000 plateaux théoriques pour le dernier isomère (pic C).

Globalement, une température de colonne élevée permet d’améliorer la séparation des trois isomères de SBE-β-CD monosubstituée : entre 30 et 75°C, la résolution passe de 2,4 à 4 entre les pics A et B et de 1 à 2,5 entre les pics B et C.

En résumé, l’augmentation de la température de la colonne a un effet bénéfique sur la séparation, en partie grâce à une meilleure efficacité, ce qui est le phénomène attendu [4, 5].

Notons toutefois que la comparaison rigoureuse de résultats obtenus dans différentes conditions chromatographiques nécessite de travailler à vitesse réduite constante, ce qui n’a pas été le cas ici. En effet, le coefficient de diffusion des analytes augmente avec la température ce qui entraîne une diminution de la vitesse réduite. Il aurait donc été préférable d’accroître le débit de la phase mobile à mesure que la température de la colonne augmentait.

Afin de déterminer si les mécanismes de rétention à 75°C sont les mêmes qu’à température ambiante, l’étude de l’influence de la composition de la phase mobile a été effectuée à cette température.