Influence de la concentration de DM- β-CD dans la phase mobile

Après avoir mis en évidence un phénomène d’adsorption de la DM-β-CD sur le PGC et observé que la quantité adsorbée est très dépendante de sa concentration dans la phase mobile, nous avons étudié l’influence de cette même concentration sur la rétention et l’énantiosélectivité des deux solutés test, la 5M5PH et l’hexobarbital.

La figure 3.5 montre les chromatogrammes obtenus avec une phase mobile H2O/ACN (80/20) et contenant de 0 à 32 mM de DM-β-CD de DS 2,1.

CHAPITRE 3 – Evaluation du système chromatographique carbone graphite poreux /

β-cyclodextrines méthylées pour la séparation chirale en CPL.

Références bibliographiques : p. 123 - 125. 101 HEXOBARBITAL 5M5PH 0 mM 2 mM 4 mM 8 mM 16 mM 32 mM 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 5 10 15 20 Temps (min) Intensité (mV)

Figure 3.5. Influence de la concentration de DM-β-CD (DS 2,1) dans la phase mobile sur la rétention de la 5M5PH et de l’hexobarbital.

Conditions : colonne Hypercarb (100 x 2,1 mm ; 5µm) ; phase mobile H2O/ACN (80/20) + DM-β-CD (DS 2,1) ; débit : 0,2 mL/min ; température ambiante ; détection UV.

En l’absence de CDs dans la phase mobile, les énantiomères ne sont bien évidemment pas séparés. Le pic correspondant à l’hexobarbital est relativement large et traduit une faible efficacité de colonne. Celle-ci aurait pu être améliorée en ajoutant 0,1 ou 1% d’acide trifluoroacétique dans la phase mobile comme il est courant de le faire sur le PGC. Toutefois, nous voulions maintenir une phase mobile de composition simple qui soit compatible avec les colonnes C18. Nous nous sommes donc interdit l’emploi de TFA et avons continué dans ces conditions.

L’ajout de seulement 2 mM de CDs dans la phase mobile permet la séparation des deux énantiomères de chaque soluté. Les chromatogrammes montrent

clairement que la concentration en CDs a une influence tant sur la rétention que sur l’énantiosélectivité des solutés.

La figure 3.6 montre l’influence de cette concentration sur la rétention du second énantiomère de chacun des solutés pour différentes proportions d’ACN. On peut constater que, globalement, lorsque la concentration en CDs augmente, la rétention des deux solutés diminue, ce qui est le résultat de deux phénomènes.

5M5PH 0 2 4 6 8 0 5 10 15 20 25 30 35 [DM -β -CD] (mM) k 15% ACN 20% ACN 25% ACN 30% ACN Hexobarbital 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 5 10 15 20 25 30 35 [DM-β -CD] (mM) k 15% ACN 20% ACN 25% ACN 30% ACN

Figure 3.6. Influence de la concentration de DM-β-CD (DS 2,1) dans la phase mobile sur la rétention du second énantiomère de chacun des solutés.

Conditions : colonne Hypercarb (100 x 2,1 mm ; 5µm) ; phase mobile H2O/ACN + DM-β-CD (DS 2,1) ; débit : 0,2 mL/min ; température ambiante ; détection UV.

Le premier phénomène, classique et attendu dans ces conditions, est la formation de complexes entre les solutés et les CDs en excès croissant dans la phase mobile. Cette complexation entraîne une diminution des interactions hydrophobes possibles entre les solutés et la phase stationnaire et donc une diminution de leur rétention [45]. Les complexes sont en effet généralement moins retenus que les solutés seuls à cause de l’hydrophilie des CDs [46].

A ce phénomène, il faut rajouter, dans notre cas, le fait que la quantité de CDs adsorbée sur le PGC augmente avec leur concentration dans la phase mobile, ce qui a pour effet de masquer la surface du PGC et d’en réduire l’accès aux solutés [25].

CHAPITRE 3 – Evaluation du système chromatographique carbone graphite poreux /

β-cyclodextrines méthylées pour la séparation chirale en CPL.

Références bibliographiques : p. 123 - 125. 103

exemple, entre 0 et 32 mM de CDs dans la phase mobile, le facteur de rétention de l’hexobarbital est divisé par 4,8 alors que celui de la 5M5PH n’est divisé que par 1,7. Cette différence indique que l’hexobarbital forme un complexe plus stable en solution que ne l’est celui de la 5M5PH [47, 48]. Cela peut s’expliquer par la plus grande hydrophobicité de l’hexobarbital (tableau 3.1). Le fait que ce soluté soit plus complexé que la 5M5PH par ces DM-β-CDs sera d’ailleurs confirmé dans le chapitre 4.

On peut remarquer qu’avec une phase mobile composée de 15 ou 20% d’ACN et contenant 2 mM de DM-β-CD, la rétention de l’hexobarbital est tout d’abord légèrement accrue. Ce phénomène, observé en CPL sur colonne C18 [49, 50] et en CPS [25] a pour origine la complexation des solutés par les CDs adsorbées sur la phase stationnaire. Nous avons vu que même à 2 mM seulement de CDs dans la phase mobile, il y a génération d’une phase stationnaire chirale, constituée de CDs adsorbées. Les solutés complexés sont donc ralentis au niveau de la phase stationnaire. A plus grandes concentrations en CDs, c’est la complexation au sein de la phase mobile qui devient prépondérante et les solutés complexés sont entraînés par la grande quantité de CDs présente dans la phase mobile.

5M5PH 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 0 5 10 15 20 25 30 35 [DM-β -CD] (mM) α 15% ACN 20% ACN 25% ACN 30% ACN Hexobarbital 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 0 5 10 15 20 25 30 35 [DM-β -CD] (mM) α 15% ACN 20% ACN 25% ACN 30% ACN

Figure 3.7. Influence de la concentration de DM-β-CD (DS 2,1) dans la phase mobile sur l’énantiosélectivité.

Conditions : colonne Hypercarb (100 x 2,1 mm ; 5µm) ; phase mobile H2O/ACN + DM-β-CD (DS 2,1) ; débit : 0,2 mL/min ; température ambiante ; détection UV.

L’influence de la concentration de DM-β-CDs dans la phase mobile sur l’énantiosélectivité est montrée dans la figure 3.7. Le comportement des 2 solutés

diffère largement. En effet, pour la 5M5PH, l’énantiosélectivité augmente avec la concentration en CDs, rapidement d’abord puis de façon plus modérée. D’une manière générale, l’énantiosélectivité est en effet accrue lorsque la concentration en CDs augmente, que ce soit en CPS [25] ou en CPL [1-3, 7]. Notons qu’avec 30% d’ACN, les énantiomères ne sont plus séparés.

L’hexobarbital montre un comportement tout à fait différent. Les énantiomères ne sont séparés qu’à faibles concentrations de DM-β-CDs et l’énantiosélectivité est maximale à 2 mM. Pour de plus grandes concentrations, aucune séparation n’est observée. Il semble donc que les énantiomères de l’hexobarbital ne soient séparés que lorsque la complexation a principalement lieu au niveau de la phase stationnaire. Pour la suite de notre étude, nous travaillerons principalement avec une concentration de DM-β-CDs dans la phase mobile égale à 2 mM afin d’avoir une séparation des énantiomères de chacun des solutés.