Analyse par CPL

La Me-β-CD a ensuite été analysée par CPL afin d’obtenir une empreinte chromatographique du mélange et en évaluer la réelle complexité. La CPL permet en effet de distinguer les isomères de substitution et apporte donc des informations complémentaires sur les constituants du mélange.

La chromatographie à polarité de phases inversée (RPLC) a été préférée à la chromatographie à polarité de phases normale (NPLC) en vue d’effectuer le couplage CPL-ESI-SM. Les solvants utilisés en RPLC sont en effet plus compatibles avec cette technique d’ionisation [29] et ne nécessitent pas l’ajout d’un liquide additionnel.

Toutefois, avant que le couplage ne soit réalisé, la séparation a été optimisée avec une détection par DEDL. En effet, comme les SBE-β-CDs, les Me-β-CDs n’absorbent pas en UV et le DEDL a déjà été utilisé avec succès pour l’analyse de DM-β-CDs par CPL et SFC [30].

De précédents travaux ont montré que la résolution de mélanges complexes de DM-β-CDs par RPLC est grandement influencée par la nature du support chromatographique utilisé [31, 32]. En effet, parmi diverses colonnes greffées C8,

CHAPITRE 2 – Caractérisation de β-cyclodextrines sulfobutylées et méthylées

Références bibliographiques : p. 85 – 87. 63

performances. Les colonnes Nucléosil 50-5-C8 [32] et Zorbax Phényle [31] sont apparues comme les meilleures alternatives pour obtenir de bonnes séparations. En outre, pour ces analyses, les phases mobile H2O/ACN ont montré de meilleures sélectivité et efficacité que les phases mobiles H2O/MeOH [31].

Les présents travaux ont donc été entrepris dans un premier temps avec ces deux colonnes chromatographiques (voir leurs caractéristiques en annexe III) et une phase mobile composée d’eau et d’ACN. Un gradient d’élution a été nécessaire pour séparer les différents constituants du mélange. La figure 2.7 montre que ces deux colonnes, de dimensions similaires mais ayant des greffons différents, fournissent des empreintes chromatographiques comparables, tant au niveau de la rétention que de la sélectivité. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 5 10 15 20 25 30 Temps (min) Intensité (mV) Nucleosil 50-5-C8 Nucleosil Phenyl Hypercarb Zorbax Phenyl

Figure 2.7. Comparaison des chromatogrammes de la Me-β-CD obtenus sur différentes colonnes.

Conditions : colonnes Nucléosil C8 (250 x4,6 mm ; 5µm), Zorbax Phényl (250 x 4,6 mm ; 7µm), Nucléosil phényl (150 x 4,6 mm ; 7 µm), Hypercarb (100 x 4,6 mm ; 5 µm) ; phase mobile : H2O/ACN 95/5 à 55/45 en 40 min ; débit : 1 mL/min ; détecteur : DEDL.

La même analyse a été menée sur une colonne Nucléosil Phényle afin d’observer l’influence du support chromatographique d’une part, et celle de la nature des greffons d’autre part. Le chromatogramme obtenu montre une plus faible sélectivité qu’avec les deux colonnes précédentes, ce qui souligne à nouveau l’importance du choix de la colonne pour l’analyse des Me-β-CDs.

Cette Me-β-CD étant moins méthylée que les DM-β-CDs, elle est aussi plus polaire et moins hydrophobe. Afin d’obtenir une empreinte chromatographique plus riche pour cette Me-β-CD, il s’est avéré judicieux de l’analyser sur une colonne présentant des interactions hydrophobes renforcées par rapport à celles des colonnes précédentes. Les caractéristiques de la colonne Purospher Star RP18 EC (silice très pure sans trace de métaux, greffage et désactivation des silanols résiduels ayant pour conséquence une structure de type multicouches) en font un support très hydrophobe. Comme le montre la figure 2.8, l’utilisation de cette colonne, pourtant plus courte que les précédentes, a permis l’obtention d’une plus grande sélectivité et d’une meilleure efficacité.

0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 Temps (min) Intensité (mV) 1 2 3 4 5 6

Figure 2.8. Chromatogramme de la Me-β-CD obtenu sur colonne Purospher Star RP18 EC (125 x 4 ; 5 µm).

Conditions : phase mobile : H2O/ACN 95/5 à 55/45 en 40 min ; débit : 1 mL/min ; détecteur : DEDL.

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Références bibliographiques : p. 85 – 87. 65

Puisque l’augmentation des interactions hydrophobes s’est révélée avantageuse, il nous a semblé alors intéressant de transposer l’analyse sur un support de carbone graphite poreux (PGC). Ce support est en effet plus hydrophobe que les colonnes à base de silice greffées C18 et permet la séparation de composés structurellement proches, comme nous l’avons vu pour les trois isomères de la

SBE-β-CD monosubstituée (partie A). Toutefois, l’utilisation de cette colonne conduit à un chromatogramme caractérisé par une faible résolution des différents groupes de pics ainsi qu’à une faible efficacité (figure 2.7).

L’étude a donc été poursuivie avec la colonne Purospher Star, qui, comme le montre la figure 2.8, a permis l’obtention de l’empreinte chromatographique la plus riche. Le chromatogramme, obtenu en utilisant un gradient d’élution, se compose de plusieurs pics de différentes intensités ayant des temps de rétention compris entre 3 et 21 min. Ceci est un indice de l’hétérogénéité du mélange et en particulier de la large gamme de polarité des constituants. A l’opposé, les principaux constituants des mélanges de DM-β-CDs sont séparés en condition isocratique [30-32]. En résumé, la gamme de polarité des constituants de cette Me-β-CD faiblement substituée est plus large que celle des mélanges de DM-β-CDs. L’addition d’un groupement méthyle semble donc modifier plus fortement les propriétés d’une CD portant seulement 5 groupes méthyle que celles d’une CD portant déjà 14 groupes méthyles.

Afin d’obtenir plus d’informations sur les constituants de cette Me-β-CD, leur identification par SM a été envisagée. Le spectromètre MALDI-SM étant le seul disponible à ce stade des travaux, le mélange brut a été fractionné par chromatographie semi-préparative afin d’en analyser chacune des fractions par MALDI-SM. Comme l’indique la figure 2.8, les pics détectés par DEDL ont été regroupés en 6 groupes selon leurs temps de rétention. Ces différents groupes ont tout d’abord été considérés comme correspondant aux CDs portant différents nombres de groupes méthyle, les dérivés les plus retenus étant les plus substitués car les plus apolaires, comme dans le cas des DM-β-CDs [31, 32].

Le fractionnement a donc été conduit en augmentant la concentration de l’échantillon injecté, de 2 à 10 g/L. La résolution n’a pas été modifiée par cette surcharge, montrant la grande capacité de cette colonne. Six fractions ont ainsi été collectées correspondant aux six groupes de pics de la figure 2.8.

Le DEDL étant un détecteur destructif, il a été déconnecté du système chromatographique pendant le fractionnement afin de récupérer le maximum d’échantillon. L’isolement des fractions a ainsi été conduit sans détection et uniquement sur la base du suivi des temps de rétention. Afin de vérifier la pureté des fractions collectées, celles-ci ont ensuite été analysées par RPLC dans les mêmes conditions que le mélange brut. La figure 2.9 comparée à la figure 2.8 met en évidence que le fractionnement « en aveugle » a bien été effectué comme prévu : chaque fraction collectée contient le mélange de constituants sélectionné sur la figure 2.8.

Figure 2.9. Chromatogrammes des fractions de Me-β-CD obtenus sur colonne Purospher Star RP18 EC (125 x 4 ; 5 µm).

Conditions : phase mobile : H2O/ACN 95/5 à 55/45 en 40 min ; débit : 1 mL/min ; détecteur : DEDL. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 5 10 15 20 Temps (min) Intensité (mV) Fraction 6 Fraction 1 Fraction 2 Fraction 3 Fraction 4 Fraction 5 1 2 3 4 5 6

CHAPITRE 2 – Caractérisation de β-cyclodextrines sulfobutylées et méthylées

Références bibliographiques : p. 85 – 87. 67

Ces fractions ont ensuite été analysées par spectrométrie de masse en mode MALDI afin de déterminer la masse des composés à l’intérieur de chacune d’elles et d’élucider les mécanismes de rétention en jeu dans cette séparation.