Caractérisation des SBE-β-CDs

Afin de faire ressortir la puissance croissante des méthodes utilisées pour la caractérisation des mélanges de SBE-β-CDs, celles-ci seront discutées par ordre chronologique.

Dans les brevets décrivant la synthèse des SBE-β-CDs, la caractérisation des mélanges obtenus est sommaire [31, 32]. En effet, les seules indications de la composition du mélange sont le DS moyen, obtenu par analyse élémentaire (AE) à partir du rapport carbone/soufre, et la teneur en β-CD résiduelle, déterminée par CCM.

Dès 1992, une méthode d’EC est mise au point pour analyser ces mélanges et en révéler la complexité puis elle est améliorée quatre ans plus tard [42, 43]. Les SBE-β-CDs sont chargées sur toute la gamme de pH et la mobilité électrophorétique d’un analyte est fonction de sa charge. Les différents constituants sont donc séparés selon le nombre de substituants, autrement dit selon leur DS. L’électrophérogramme ainsi obtenu montre le profil de substitution qui permet d’estimer la proportion relative apparente de chacun des DS (figure 1.7).

Cette méthode est alors utilisée pour évaluer la reproductibilité de la synthèse des SBE-β-CDs et l’influence des conditions de réaction (durée, température, basicité) sur la distribution des dérivés obtenus.

CHAPITRE 1 – Etude bibliographique

Références bibliographiques : p. 42 – 44. 31

Figure 1.7. Electrophérogramme d’un mélange de SBE-β-CDs de DS moyen égal à 4.

Conditions : capillaire de 50 µm de diamètre interne, 60 cm de longueur totale et 30 cm de longueur effective ; électrolyte support constitué de 30 mM de tampon acide benzoïque-Tris à pH 6 ; champ électrique de 417 V/cm ; détection indirecte à 230 nm ; injection hydrodynamique de 5 sec à 0,5 psi ; température ambiante. D’après [43].

En 1996, les SBE-β-CDs sont analysées par spectrométrie de masse (SM) en mode positif avec différentes techniques d’ionisation : ESI, MALDI et FAB [44]. Les différents DS présents au sein du mélange sont identifiés sous forme d’adduits du type [M+Na]⁺. La technique FAB souffrant d’un bruit de fond important, seuls l’ESI et le MALDI sont considérés adaptés à l’analyse rapide de ces molécules. Toutefois, le processus de formation des ions n’étant pas le même, les intensités relatives des pics varient d’une technique à l’autre et les spectres obtenus à partir d’un même mélange ne montrent pas le même profil de substitution (figures 1.8 et 1.9).

Figure 1.8. Spectre de masse ESI de SBE-β-CDs (DS 0 à 6) en mode positif.

Conditions : solvant d’infusion : eau ; débit d’infusion : 2-10 µL/min ; tension de spray : 5 kV ; tension d’orifice : 80-180 V. D’après [44].

Figure 1.9. Spectre de masse MALDI de SBE-β-CDs (DS 0 à 7) en mode positif.

Conditions : matrice : 0,2 mol d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque et 0,6 mol de 1-hydroxyisoquinoline dans un mélange H2O/ACN 50/50 ; tension d’accélération : 28 kV. D’après [44].

En 1997, un mélange de SBE-β-CDs est fractionné par chromatographie préparative d’échange d’ions avec un gradient de sel [45]. Les différents DS sont isolés et caractérisés par EC (méthode ci-dessus), RMN et SM afin d’en vérifier la pureté. Le but est d’expliquer les différences observées entre les valeurs de DS moyen obtenues par AE et RMN d’un côté et par EC de l’autre. Il est montré que la réponse des SBE-β-CDs en EC augmente avec le DS et le DS moyen calculé en prenant cette augmentation en compte est plus proche des valeurs obtenues en AE et RMN.

Ces travaux sont poursuivis par une étude se focalisant sur le DS 1 qui ne compte que trois isomères correspondant aux trois positions de substitution d’une unité glucopyranose (positions 2, 3 et 6) [46]. En adaptant la méthode de chromatographie préparative d’échange d’ions précédente, chacun des isomères est isolé, caractérisé par EC, et identifié par RMN 2D. Cette étude permet pour la première fois d’étudier les isomères de position et de déterminer les positions de substitution préférentielles (figure 1.10).

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Figure 1.10. Electrophérogramme des trois isomères de la SBE-β-CD de DS 1.

Conditions : capillaire de 50µm de diamètre interne, 120 cm de longueur totale et 90 cm de longueur effective ; électrolyte support constitué de 15 mM de tampon acide benzoïque-Tris à pH 6 ; champ électrique de 167 V/cm ; détection indirecte à 230 nm ; injection hydrodynamique de 1 sec à 5 psi ; température ambiante. D’après [46].

En 1999, la caractérisation des SBE-β-CDs est poursuivie en utilisant la chromatographie de paire d’ions [47]. Après une étude de l’influence de la nature et de la concentration d’amines aliphatiques (utilisées comme agents de paire d’ions) et de la nature du modificateur organique, une séparation des différents DS est obtenue (figure 1.11). Celle-ci est complémentaire de la méthode mise au point en EC.

Figure 1.11. Empreinte chromatographique d’une SBE-β-CD de DS moyen égal à 7.

Conditions : colonne Spherisorb ODS 1 (250 x 4,6 mm) ; éluant A : formiate d’heptylammonium à 5 mM, éluant B : MeOH ; gradient de 30 à 50% de B en 25 min puis 50% de B pendant 15 min ; débit : 1 mL/min ; détection par DEDL. D’après [47].

Toutefois, l’agent d’appariement d’ions, même compatible avec le DEDL, pose des problèmes de transposition en SM à cause des nombreux adduits formés avec les analytes et rend la chromatographie préparative plus problématique.

En 2000, une nouvelle méthode CPL est mise au point par chromatographie d’échange d’ions [48]. Utilisant des compétiteurs électroniques volatils compatibles avec le DEDL, la méthode permet de séparer les différents DS des mélanges de SBE-β-CDs (figure 1.12) et de les isoler de façon semi-préparative.

Figure 1.12. Empreintes chromatographiques de deux échantillons de SBE-β-CDs de DS 5,3 (échantillon B) et 3,5 (échantillon D).

Conditions : colonne Vydac 302 IC (250 x 4,6 mm) ; éluant A : 10 mM d’acétate d’ammonium dans H2O/ACN (70/30), éluant B : 250 mM d’acétate d’ammonium dans H2O/ACN (70/30) ; gradient : 100% de A pendant 5 min à 100% de B en 20 min ; débit : 1 mL/min ; détection par DEDL. D’après [48].

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En 2001, cette méthode est couplée à l’ESI-SM en mode négatif afin d’identifier les différents DS en ligne (figure 1.13) [49]. Les DS moyen calculés par SM, CPL-DEDL et CPL-SM sont similaires.

Figure 1.13. Empreinte chromatographique obtenues en SIM d’un échantillon de SBE-β-CD de DS moyen 5,0.

Détection en mode SIM des ions [M-2H]^2-. Même conditions chromatographiques que la figure 1.12. Conditions de SM : tension de spray : -4,8 kV ; tension d’orifice : -60 V. D’après [49].

En 2002, différentes β-CDs sulfoalkylées sont synthétisées et caractérisées par AE, RMN et SM afin d’en déterminer le DS moyen ainsi que les positions de substitution préférentielles [50]. D’après les auteurs, pour les SBE-β-CDs, des conditions de synthèse très basiques favoriseraient la substitution des groupes hydroxyle en position 6.

La même année, une thèse préparée au sein du laboratoire rapporte l’analyse de CDs anioniques, dont les SBE-β-CDs, en ESI-SM, EC et CPL-ESI-SM sur colonne de carbone graphite poreux (PGC) [33]. Le PGC se révèle être un outil de choix pour l’analyse des différents DS du mélange ainsi que pour la séparation des 3 isomères de la SBE-β-CD DS1 (figure 1.14). Ceux-ci sont ainsi isolés de manière semi-préparative et identifier par RMN 2D. Cette méthode permet ainsi de déterminer les positions de substitution préférentielle et d’étudier l’influence des conditions de synthèse sur la sélectivité de la réaction.

Figure 1.14. Séparation des trois isomères de la SBE-β-CD de DS1 sur colonne Hypercarb.

Conditions : colonne hypercarb (100 x 4,6 mm ; 5 µm) ; phase mobile : 50 mM de tampon acide formique/ammoniaque pH 3 dans H2O/ACN 81/19 ; débit 1 mL/min ; détection par DEDL. Les SBE-β-CDs notées 1, 2 et 3 sont substituées en position 3, 6 et 2, respectivement. D’après [33].

Comme nous venons de le voir, la caractérisation des mélanges de SBE-β-CDs a nécessité la mise au point de plusieurs méthodes et outils. Parmi ceux-ci, le PGC offre une intéressante capacité de séparation des isomères et permet d’obtenir des informations supplémentaires quant à la sélectivité de la substitution.