Les infiltrats de LT CD8 + et de cellules myéloïdes sont tous deux nécessaires à la

Comme les données précédentes ont montré que les LT CD8+ _{étaient assez rares au début de la}

régression tumorale, il parait légitime de s’interroger sur leur contribution dans la phase effectrice de la régression. Pour le tester, nous avons éliminé les LT CD8+ _{quelques jours avant la}

régression tumorale, à jour 5, par injection intra-péritonéale d’un anticorps déplétant anti-CD8. Le résultat fut sans appel, toutes les tumeurs des souris traitées avec l’anti-CD8 ont continué à progresser (Figure 15A). Nous avons fait de même pour les LT CD4+_{, mais leur absence n’a pas}

bloqué la phase de régression. Malgré leur arrivée tardive, les CD8+ _{jouent donc bien un rôle}

Par ailleurs, l’analyse transcriptomique avait révélé que les chimiokines CXCL9 et CXCL10,

importantes pour le recrutement de LT au site d'inflammation, étaient retrouvées en grande quantité dans les tumeurs après vaccination (Figure 15B). Le récepteur de ces chimiokines étant CXCR3, nous avons reproduit notre modèle de régression tumorale dans des souris déficientes pour CXCR3. Cette expérience a été faite dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe de J-P Abastado, et le soutien scientifique et technique de Kar Wai Tan et Xian Leong Penny. Les résultats obtenus furent alors surprenants, car malgré une diminution de la fréquence

intratumorale de LT CD8 d’un facteur 4 dans les souris CXCR3-/- _{(Figure 15C), les tumeurs ont}

quand même amorcé une régression (Figure 15D). L’analyse transcriptomique a aussi permis d’observer une corrélation entre l’expression de CD8 et celles des cytokines CCL3 et CCL5, probablement impliquées dans le recrutement des TIL (Figures 15E et F). La prise en compte

de l'ensemble de ces résultats montre que les LT CD8 sont incontestablement nécessaires à la régression des tumeurs TC1, mais qu’ils peuvent difficilement être les seuls acteurs cytotoxiques au sein de la tumeur.

Figure 15 : Les cellules CD8+ _{sont nécessaires à la régression tumorale induite par la vaccination.} A. L’absence des cellules CD8+ _{inhibe totalement la régression tumorale, alors que les CD4 ne sont pas} nécessaires lors de la phase effectrice. Les courbes (moyennes de 8 à 12 souris) montrent les tailles des tumeurs après les traitements anti-CD4, anti-CD4, ou les contrôles. B. L’analyse transcriptomique a montré que CXCL9 et CXCL10 étaient surexprimés après la vaccination. C. Dans les souris CXCR3KO, l’infiltrat CD8 dans les tumeurs est considérablement réduit par rapport aux souris contrôles. D. La croissance tumorale dans les souris CXCR3KO est similaire à celle des souris contrôles, en absence de vaccination comme après vaccination. E-F. Corrélation de l’expression de CD8 avec CCL3 ou CCL5.

Dans les conditions contrôles, la grande majorité des cellules CD11b+ _{exprime peu ou pas CD11c}

(CD11c neg/low_{). Ces cellules peuvent être séparées en trois sous-populations différenciées par leurs}

niveaux d’expressions de F4/80 et Ly6C. Ces populations sont les monocytes inflammatoires (F4/80int _Ly6Chi_{), les macrophages (F4/80}hi _Ly6Cneg_{), et les granulocytes, F4/80}neg _Ly6Cint_{). Afin}

avons traité des souris vaccinées avec du PLX3397, un inhibiteur de la signalisation en aval du récepteur au CSF1 (DeNardo et al. 2011). L’administration du PLX3397 se fait par le biais de la nourriture, et faisant effet sous deux à trois jours, les souris ont été traitées à partir du jour du

priming. Ce traitement a engendré une diminution de moitié des cellules CD11b+ _{intratumorales,}

et réduit d’un facteur 5 la population cellulaire F4/80+ _{(Figures 16A et B). Suite à ce traitement,}

les tumeurs n’ont pas régressé mais se sont stabilisées (Figure 16C). Dans ces conditions, l’élimination des CD8 inhibe l’efficacité de la vaccination et les tumeurs progressent. La spécificité des LT CD8+ _{pour l’antigène E7 a été vérifiée durant la phase effectrice à jour 10 par}

l’utilisation de dextramères E7, et leur fréquence reste aussi élevée dans les souris traitées PLX3397 que dans ses souris contrôles vaccinées, avec environ 40% de LT CD8+ _{spécifiques de}

l'épitope Kb/E7 à jour 10 (Figure 16D). Ce résultat est important car il montre que le traitement PLX3397 n’interfère pas avec le priming des cellules T. Précisons que ce résultat ne signifie pas que le nombre de T CD8 dans la tumeur est inchangé, en réalité il a légèrement diminué. Étant donné que le priming n’a pas été perturbé par le traitement, cette diminution des LT CD8 infiltrants, dépendant de leur recrutement, est liée à la déplétion des macrophages intratumoraux.

Ces données montrent ainsi que les cellules myéloïdes intratumorales sont nécessaires à l’élimination des tumeurs suite à la vaccination.

Figure 16 : La déplétion des cellules myéloïdes bloque la régression tumorale. A. Exemple

représentatif de dot plots montrant la déplétion myéloïde après traitement par PLX3397 B. Pourcentage de cellules myéloïdes CD11b+ _{parmi les cellules vivantes, et de deux de ses sous-populations, les monocytes} (Ly6Chi_{) et les macrophages (TAM), après vaccination, et avec ou sans PLX3397 C. Après la déplétion des} cellules myéloïdes par le PLX3397, le traitement vaccin E7+IFN conduit à la stabilisation des tumeurs, alors que les tumeurs des souris traitées avec de la nourriture contrôle régressent. La croissance tumorale est restaurée lorsque les souris reçoivent un anti-CD8 en plus du PLX3397. Les courbes montrent la variation du volume tumoral par rapport à jour 7 (moyenne +/- SEM, avec 5 à 8 souris par groupe, de 2 à 3 expériences indépendantes). D. La déplétion des cellules myéloïdes ne perturbe pas le priming des LT CD8 spécifiques de Kb/E7, comme le montre la quantification des CD8 spécifiques intratumoraux à l’aide de dextramères à partir de souris vaccinées contrôles (haut), ou en plus traitées par le PLX3397 (bas). A droite, le graphique montre la quantification de deux expériences indépendantes.

Nous avons utilisé une autre approche pour réduire l’infiltrat myéloïde intratumoral afin de confirmer ces résultats. Nous avons pour cela implanté les cellules TC1 dans des souris déficientes pour CCR2, le récepteur de CCL2, dans lesquelles le recrutement des monocytes est inhibé. La fréquence de cellules myéloïdes infiltrantes a bien été diminuée, tout comme l’efficacité de la vaccination (Figure 17A).

Enfin, il était important de confirmer cela dans un autre modèle de tumeur. Nous avons utilisé les cellules tumorales EG7, qui ne sont autres que les cellules EL4 (modèle de thymome) exprimant l’ovalbumine de poulet. La régression tumorale, induite par le vaccin STxB-OVA combiné à l’IFN, est aussi dépendante de l’infiltrat myéloïde (Figure 17B).

Figure 17 : La vaccination de souris CCR2KO transplantées avec les cellules TC1 et du modèle tumoral EG7 traité par PLX confirment l’importance des cellules myéloïdes lors de phase de régression. A. Dans des souris déficientes pour CCR2, la vaccination induit une stabilisation des tumeurs, mais pas de régression. B. Dans un modèle de tumeurs EG7, la régression tumorale induite par la vaccination STxB-OVA/IFN est aussi bloquée en présence de PLX3397.