Inuence des précisions temporelle et de localisation et optimisation 151

Plusieurs facteurs de mesure inuencent la précision obtenue sur D :

• l'incertitude de reconstruction de la position σ0de la source image par image, appelée erreur statique ;

• l'incertitude dynamique σ créée par l'échantillonnage temporel ni de la trajectoire. X. Michalet [4] et A.Berglund [5] ont modélisé l'inuence de ces deux erreurs sur la mesure du MSD.

L'erreur dynamique dépend du coecient de diusion de la particule et du temps d'intégration d'une image :

σ ≈ σ₀ s 1 + ^DtE s2 0 (5.20) avec tE le temps d'intégration, D le coecient de diusion, s2

0 est la variance de la PSF du détecteur.

L'erreur augmente avec D et le temps d'intégration. En eet, ces deux paramètres régissent la précision temporelle du mouvement.

Cette erreur est propagée dans la mesure du MSD [6] :

ρ(i∆t) = 2d σ²− 2RD∆t
+ 2dDi∆t (5.21) = α + βi∆t (5.22) R = ¹ ∆t Z ∆t 0 S(t) [1 − S(t)] dt (5.23)

avec i le nombre d'itérations entre deux positions, ∆t la durée d'une image et S(t) le pourcentage d'illumination d'une image au temps t. Pour une illumination constante, R = ¹₆.

Le résultat de l'Eq.5.21 montre le biais introduit par ces erreurs dans la fonctions ρ(n). Les paramètres σ(D) et D ne sont pas connus a priori. Une estimation de D permettrait une meilleure dénition de l'erreur de mesure et ainsi une meilleure connaissance de D par itération.

An d'améliorer la précision sur le coecient de diusion D, X. Michalet et A.Berglund ont utilisé un calcul de Cramér-Rao pour comparer deux méthodes :

• une méthode de maximum de vraisemblance ;

• un calcul des moindres carrés optimisé en déterminant le nombre idéal de points p_min à utiliser dans le calcul :

p_min ≈ E2 + 2.3x0.52

(5.24) x = ^σ

2

D∆t − 2R (5.25)

Le calcul de Cramér-Rao a montré que le résultat est semblable pour les deux méthodes. Dans la suite, la méthode des moindres carrés optimisée sera utilisée pour calculer D.

Nous essayerons de voir si le comptage de photon permet de limiter l'inuence du outage. De plus, nous verrons l'inuence de la précision temporelle par rapport à la précision de localisation à fort coecient de diusion : pour un fort D, est-ce que la diminution de l'erreur statique obtenue par accumulation de photons est susante pour réduire la perte de précision due au outage ?

5.3.3 Comparaison théorique des détecteurs emCCD et ebCMOS

pour la mesure du MSD

Les capteurs emCCD et ebCMOS en mode comptage de photons se distinguent par trois facteurs importants pour la mesure de D :

1. L'ecacité quantique de l'ebCMOS est plus faible, d'un facteur 3 à 4 pour des lon-gueurs d'onde adaptées en ne prenant pas en compte l'ecacité quantique eective. 2. La cadence de lecture de l'ebCMOS est 15 fois plus grande que pour l'emCCD. L'erreur dynamique sur la mesure de D est moins importante mais l'erreur statique est plus grande car le nombre de photons diminue.

3. L'ebCMOS permet une détection des photons à une précision de 2 µm (pour un pixel de 10 µm de côté), alors que les photons détectés par l'emCCD le sont par pixels.

An de mesurer l'inuence des ces diérences sur la mesure du coecient de diusion, une simulation Monte-Carlo a été implémentée. Pour chaque particule, des pas δt de 2 ×10−1 ms ont été simulés. La distance parcourue entre chaque pas suit une distribution aléatoire gaussienne de variance σD :

σ_D =√

2Dδt (5.26)

L'erreur sur la position pour le capteur ebCMOS est simulée par un écart à la position vraie aléatoire suivant une distribution gaussienne d'écart-type égal à la PSF du détecteur à laquelle il faut ajouter l'erreur de reconstruction du photon. Dans le cas de l'emCCD, seule la PSF optique est simulée. Par contre, la position du photon n'est mesurable qu'en unités de pixels de 16 µm.

Pour chaque pas simulé, un photon est émis. La probabilité que le détecteur le mesure dépend de son ecacité quantique, ici 25 % pour l'ebCMOS et 80 % pour l'emCCD. L'ecacité quantique eective et l'erreur de comptage des photons de l'emCCD n'ont pas été prises en compte dans la simulation.

La cadence de lecture choisie est de 2 ms (10 pas) pour l'ebCMOS et 30 ms (150 pas) pour l'emCCD, ce qui correspond aux valeurs utilisées pour une mesure en grand champ de vue pour les deux caméras.

La Fig.5.12 montre la distribution des coecients de diusion mesurées pour l'emCCD et l'ebCMOS pour des trajectoires de 4 et 40 secondes pour quatre valeurs de D : 10−3, 10⁻², 10−1 et 1 µm2s−1. /s] 2 m µ D [ 0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 Entries [%] 0 1 2 3 4 5 ebCMOS 40s emCCD 40s ebCMOS 4s emCCD 4s True Value (a) /s] 2 m µ D [ 0 0.005 0.01 0.015 0.02 Entries [%] 0 1 2 3 4 5 6 7 ebCMOS 40s emCCD 40s ebCMOS 4s emCCD 4s True Value (b) /s] 2 m µ D [ 0 0.05 0.1 0.15 0.2 Entries [%] 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ebCMOS 40s emCCD 40s ebCMOS 4s emCCD 4s True Value (c) /s] 2 m µ D [ 0 0.5 1 1.5 2 Entries [%] 0 2 4 6 8 10 12 ebCMOS 40s emCCD 40s ebCMOS 4s emCCD 4s True Value (d)

Figure 5.12  Distribution des coecients de diusion mesurées pour l'emCCD et l'ebC-MOS pour des trajectoires de 4 et 40 secondes. La valeur simulée du coecient de diusion est de (a) 10−3, (b) 10−2, (c) 10−1 et (d) 1 µm2s−1.

Écart-type de la mesure de D [µm2s−1]

D [µm2s−1] emCCD 40 s ebCMOS 40 s emCCD 4 s ebCMOS 4 s 10⁻³ 7.85 ×10−5 1.04 ×10−4 2.56 ×10−4 3.65×10−4

10⁻² 7.23 ×10−4 6.57 ×10−4 2.33 ×10−3 2.13 ×10−3

10⁻¹ 7.19 ×10−3 4.40 ×10−3 2.27 ×10−2 1.38 ×10−2

1 7.21 ×10−2 3.93 ×10−2 2.28 ×10−1 6.70×10−2

Table 5.1  Écarts-types des mesures de coecients de diusions par simulation Monte-Carlo des capteurs emCCD et ebCMOS.

Pour des coecients de diusion de 10−3 à 10−2 µm2s−1, la pixelisation et la cadence de lecture plus faible de l'emCCD permettent d'avoir une précision du même ordre de grandeur que l'ebCMOS avec sa faible ecacité quantique et sa PSF spatiale élargie. Dans ce cas, l'accumulation des photons permet une amélioration de l'erreur statique plus grande que la perte due au temps d'intégration.

Pour de plus grand coecients de diusion D, 10−1 à 1 µm2s−1, la particule se dé-place trop pour que l'augmentation du nombre de photons améliore susamment l'erreur statique. La précision obtenue pour l'emCCD se dégrade d'une facteur 2 par rapport à l'ebCMOS.