Imputation des SNPs non génotypés - IMPUTATION DES DONNÉES MANQUANTES

I. IMPUTATION DES DONNÉES MANQUANTES

3. Imputation des SNPs non génotypés

Plus de 80 millions de SNPs répartis sur le génome entier sont aujourd’hui répertoriés dans la base de données publique dbSNP198_{. Pour des questions de coût et de temps et malgré les}

avancées technologiques, il est impossible de génotyper tous ces SNPsj. La puce iCOGS ne contient qu’une infime partie (moins de 0,01 %) de l’ensemble des SNPs connus. Toutefois, à partir des SNPs génotypés, il est possible de prédire la valeur des SNPs non génotypés grâce au déséquilibre de liaison (DL) entre les SNPs d’une même région (Annexe 5, page 276). Les SNPs de la puce ont été sélectionnés pour leur capacité à marquer un groupe de SNPs ou même une région entière grâce à ce déséquilibre de liaison. On parle de marqueurs. Ces derniers sont en DL avec un nombre important d’autres SNPs localisés sur le même haplotype, ce qui nous permet alors de prédire la valeur des SNPs non génotypés de façon assez précise grâce à leur imputation à l’aide d’une base de données de génomes entiers de référence, comme ceux présents dans le panel de référence 1000Génomes199. Cependant, la

puce iCOGS ne contient pas de squelette de SNPs « marqueurs » tout le long du génome. Ce squelette, appelé backbone SNP en anglais et présent sur certaines puces (par exemple sur la puce OncoArray d’Illumina140), représente un ensemble de marqueurs localisés à équidistance et répartis sur tout le génome. Sans ce squelette, la qualité de l’imputation ne sera pas égale

j_{À l’heure actuelle, la puce à ADN la plus grande est la puce Illumina Omni 5M array. Elle contient environ 5}

entre les différentes régions du génome car certaines régions sont moins bien représentées que d’autres sur la puce. Cela a été pris en compte par la suite.

L’imputation des sujets, cas et témoins, de GENESIS a été effectuée conjointement. La première étape a été de construire les haplotypes avec le logiciel SHAPEIT200 pour ensuite inférer les SNPs non génotypés grâce à l’imputation avec le logiciel IMPUTE2201 à partir du panel de référence 1000Genomes199.

a. Pré-haplotypage avec le logiciel SHAPEIT

Pour pouvoir prédire la valeur des SNPs non génotypés, il est nécessaire de connaître la combinaison allélique de chaque sujet sur un même chromosome (haplotype) (Annexe 5, page 276). Cette combinaison allélique s’appelle la phase. Les données génotypiques que l’on obtient grâce à une puce à ADN comme la puce iCOGS ne contiennent pas cette information de phase. Une première étape de pré-haplotypage (ou pré-phasage) est donc nécessaire pour reconstruire cette information à partir de l’ensemble des génotypes d’une population étudiée. Le pré-haplotypage des sujets de GENESIS a été réalisé avec le logiciel SHAPEIT200,202_.

L’algorithme de SHAPEIT est basé sur un modèle de Markov Caché (HMM) utilisant un échantillonnage de Gibbs. Cette étape de pré-haplotypage permet de construire les haplotypes des femmes de GENESIS à partir des données de génotypage de la puce iCOGS et de la carte de recombinaison génétique issue de l’étude HapMap2203_{. Cette carte donne le taux de}

recombinaison entre des positions génétiques d’un chromosome donné. SHAPEIT définit dans un premier temps tous les haplotypes possibles pour chaque femme à partir des données génotypiques disponibles et des taux de recombinaison. Puis, selon le principe d’un échantillonnage de Gibbs, un très grand nombre d’itérations vont permettre de converger vers l’haplotype le plus vraisemblable pour chacune des femmes. À chaque itération, l’haplotype d’une femme de la population d’étude est défini à partir des paramètres de recombinaison de HapMap2 et des haplotypes de l’ensemble des femmes de l’étude à l’étape précédente (itération n-1). L’haplotype final dépend de l’haplotype de départ qui est attribué au hasard pour chaque sujet parmi tous les haplotypes possibles. Cet haplotype final n’est donc pas forcément l’haplotype le plus probable sachant les données génotypiques de la femme, mais il fait partie des haplotypes les plus probables.

Cette première étape d’haplotypage pourrait se faire simultanément à l’imputation grâce au logiciel IMPUTE2. En effet, le panel de référence utilisé par ce logiciel pour l’imputation est « phasé » (c’est-à-dire que les haplotypes des sujets sont disponibles) et permet d’imputer les génotypes non phasés de la population d’étude. Cependant, le temps de calcul serait beaucoup trop important étant donné la taille de nos données et celle des données de référence. Le panel de référence 1000Genomes contenait au départ le génome entier de 1 000 sujets différents mais aujourd’hui il contient plus de 2 500 génomes entiers. Le fait d’avoir un panel de référence de plus en plus grand augmente la puissance et la qualité de l’imputation mais également la complexité computationnelle et le temps de calcul. L’utilisation préliminaire de SHAPEIT pour phaser les génotypes de GENESIS s’accompagne donc d’une baisse de précision dans l’inférence des génotypes effectuée par la suite, mais cette baisse de précision est négligeable en regard du temps de calcul économisé.

b. Imputation avec le logiciel IMPUTE2

Description

L’imputation des SNPs non génotypés est réalisée avec IMPUTE2201,204_{à partir des}

haplotypes prédits par SHAPEIT. Un panel d’haplotypes de référence et la carte de recombinaison génétique de chaque chromosome sont nécessaires pour cette imputation. Les déséquilibres de liaison entre les SNPs non génotypés et les SNPs génotypés sont calculés à partir d’un panel de référence. Ce déséquilibre de liaison permet alors d’estimer une probabilité pour chacun des 3 génotypes possibles (AA, Aa ou aa) pour chaque SNP imputé.

Panel de référence

Le panel de référence utilisé est celui qui a été développé dans le cadre de la Phase 3 du projet

1000Genomes199. Le but de ce projet était de répertorier la majorité des variants génétiques

ayant une fréquence supérieure à 1 % à partir du séquençage du génome de 2 504 sujets. La mise en place de cette ressource donnant l’accès à la variabilité génétique humaine dans le monde entier a été possible grâce au développement des technologies de séquençage dont le coût a diminué de façon drastique. La base de données de référence 1000Genome est composée des haplotypes de 2 504 sujets de différentes origines ethniques, avec 503 sujets

d’origine européenne, 347 d’origine américaine, 489 d’origine d’Asie du sud, 504 d’origine d’Asie de l’est, et 661 d’origine africaine. Ce panel capture un large éventail de la diversité de la génétique humaine.

Avant d’effectuer l’imputation, il a été nécessaire de décider si une partie ou la totalité du panel devait être utilisé. En effet, il existe de très fortes variations de fréquence allélique selon l’origine ethnique des sujets. Certains variants sont fréquents chez les européens et quasiment absents chez les sujets d’origine africaine et inversement. Notre population d’étude étant restreinte aux femmes d’origine européenne, il semblait à première vue plus approprié d’utiliser un panel de référence composé seulement de sujets de la même origine afin de ne pas biaiser l’imputation. Cependant, les populations de 1000Genomes ont une histoire démographique complexe avec beaucoup de migrations et de mélanges ethniques. Pour la plupart des SNPs, les sujets d’origine européenne du panel de référence seront plus proches des femmes de notre étude et permettront la meilleure prédiction des SNPs à imputer. En revanche, pour certains SNPs plus rares, des sujets d’origines ethniques différentes pourront apporter de l’information supplémentaire et permettront une meilleure prédiction des SNPs non génotypés. En effet, des sujets d’origine ethnique différente peuvent partager des segments génomiques d’ancêtres communs récents et IMPUTE2 peut alors utiliser ces haplotypes communs pour améliorer la précision de l’imputation. C’est pourquoi les développeurs et utilisateurs d’IMPUTE2 préconisent d’utiliser le panel de référence complet. Les imputations ont donc été réalisées en suivant ces recommandations. Pour les mêmes raisons, nous avons utilisé tous les SNPs présents dans la base de données de référence quelle que soit leur fréquence chez les sujets européens du panel de référence.

Parmi les 5 008 (2 x 2 504) haplotypes disponibles dans la base de données de référence, IMPUTE2 sélectionne ceux à utiliser pour l’imputation. Il compare le génotype en cours d’imputation à celui de tous les sujets de 1000Genomes et sélectionne les k sujets de référence ayant le génotype le plus proche de celui dont l’imputation est en cours. C’est à partir de ces k génotypes de référence qu’il prédit la valeur des SNPs non génotypés. Il a donc fallu également déterminer le nombre d’haplotypes de référence k_hap qui devait être utilisé par IMPUTE2. Par défaut, IMPUTE2 utilise les 500 haplotypes de référence les plus proches (k_hap = 500) de l’haplotype à imputer. Afin de déterminer la valeur k_hap la plus adaptée à nos données, j’ai réalisé un test sur un fragment du chromosome 7 allant de la position

52 672 577 pb à 57 672 577 pb. Ce fragment a été imputé plusieurs fois, en faisant varier la valeur k_hap de 300 à 800 avec un incrément de 50.

Pour déterminer la valeur à utiliser pour nos imputations, j’ai utilisé le fait qu’en plus d’imputer les SNPs non génotypés, IMPUTE2 prédit également la valeur de tous les SNPs génotypés dans le but de vérifier la qualité de l’imputation (validation croisée). Cette validation croisée consiste à masquer les valeurs des SNPs génotypés une à une et à les imputer en se basant sur les haplotypes de référence et les autres SNPs génotypés. Les génotypes observés sont alors comparés aux valeurs imputées pour chaque SNP. On considère qu’une imputation est de bonne qualité si le taux de concordance entre les valeurs observées et celles prédites est supérieur ou égal à 0,95. Les résultats sont alors résumés dans des tables de concordance (Tableau 5). Celles-ci présentent le taux de concordance entre la valeur observée et celle imputée en fonction de la qualité d’imputation des SNPs. En effet, IMPUTE2 calcule un score pour chaque SNP noté r2 reflétant la qualité de l’imputation (à ne pas confondre avec le r2 représentant le déséquilibre de liaison entre deux SNPs). Le calcul de ce score est détaillé dans l’Encadré 1 page 79.

J’ai utilisé les résultats de cette validation croisée pour définir la valeur k_hap associée à une qualité d’imputation optimale. À partir des tables de concordance obtenues après chacune des imputations faites sur le même fragment du chromosome 7 (Tableau 5), on remarque que le pourcentage de concordance est équivalent pour les 11 valeurs k_hap testées (entre 0,919 % et 0,920 %) pour les SNPs associés à une forte qualité après imputation (c’est-à-dire un r2 compris entre 0,9 et 1,0). Pour les SNPs associés à une faible qualité, ce pourcentage de concordance est à 0 pour les 11 imputations.

Comme attendu, la plus grande variation concerne les SNPs associés à une qualité moyenne (r2 compris entre 0,4 et 0,7), dont la valeur fluctue d’une imputation à l’autre. Cette variation reste faible, de 1 % à 5 % et les imputations ayant la meilleure précision sont celles avec une valeur k_hap située entre 450 et 600.

Nous avons donc décidé de conserver la valeur conseillée par IMPUTE2, soit k_hap = 500. L’imputation des génotypes des femmes de GENESIS a donc été effectuée grâce aux 500 sujets du panel de référence ayant le génotype le plus proche.

Encadré 1 – Calcul du r2

Calcul du score de qualité d’imputation r2

Le score r2_{est une estimation de la qualité de l’imputation pour chaque SNP. Il correspond à l’estimation} du coefficient de corrélation entre la valeur du SNP selon l’imputation et sa valeur réelle. Ce score permet de déterminer la confiance que nous pouvons avoir dans les résultats obtenus par la suite dans les analyses d’association.

Notons Y le SNP, X le dosage estimé après imputation et i les sujets.

Alors 𝝁_𝒙= 𝝁_𝒚 et donc 𝑬(𝑿 − 𝝁_𝒙)(𝒀 − 𝝁_𝒚) = 𝑬(𝑿 − 𝝁_𝒙){(𝑿 − 𝝁_𝒙) + (𝒀 − 𝑿)}. Puis 𝑬(𝑿 − 𝝁_𝒙)(𝒀 − 𝝁_𝒚) = 𝑬(𝑿 − 𝝁_𝒙)𝟐_{+ 𝑬{(𝒀 − 𝑿)(𝑿 − 𝝁}

𝒙)}.

Pour chaque sujet, X prend la valeur xi qui est une valeur constante donc 𝑬{(𝒀 − 𝑿)(𝑿 − 𝝁_𝒙)} = (𝑬(𝒚_𝒊) − 𝒙_𝒊)(𝒙_𝒊− 𝝁_𝒙) = 𝟎 comme 𝑬(𝒚_𝒊) = 𝒙_𝒊 𝑬(𝑿 − 𝝁_𝒙)𝟐_{= ∑ (𝒙} 𝒊− 𝝁𝒙)/𝑵 𝒊 On a 𝑬(𝒀 − 𝝁_𝒀)𝟐 _{= ∑ {𝐩(𝒚} 𝒊= 𝟎)𝝁𝒚𝟐+ 𝐩(𝒚𝒊 = 𝟏)(𝟏 − 𝝁𝒚𝟐) + 𝐩(𝒚𝒊= 𝟐)(𝟐 − 𝝁𝒚𝟐)}/𝑵 𝒊 Donc

𝒓

𝟐

= 𝝆

𝟐

=

{𝑬(𝑿− 𝝁𝒙)(𝒀− 𝝁𝒚)} 𝟐 𝑬{(𝑿− 𝝁𝒙)𝟐}𝑬{(𝒀− 𝝁𝒚)𝟐}

=

𝑬(𝑿− 𝝁𝒙)𝟐 𝑬(𝒀− 𝝁𝒚)𝟐 avec 𝜌2_{l’estimation de 𝑟}2_.

Tableau 5 - Taux de concordance obtenus après imputation du fragment de 52 672 577 pb à 57 672 577 pb du chromosome 7 avec un k_hap variant de 300 à 800

k_hap = 300 k_hap = 350

Intervalle r2