1. TLR9 et ADN de Trypanosoma cruzi et brucei
L’ADN de Trypanosoma cruzi et de Trypanosoma brucei sont capables d’activer les macrophages et les cellules dendritiques (Shoda et al, 2001). Cette activation est TLR9-dépendante et augmentée en présence de DOTAP (Drennan et al, 2005 ; Bartholomeu et al, 2008).
Dans la réponse contre le Trypanosoma cruzi, l’implication de différents TLR (TLR2, TLR4, TLR9) a été démontré in vivo et in vitro (Campos et al, 2004 ; Bafica et al, 2006). Les TLR2 et TLR9 coopèrent même entre eux dans la réponse contre le parasite. En effet, alors que les souris déficientes pour le TLR9 présentent une légère augmentation de la charge parasitaire et celles pour le TLR2 ne montrent pas de différence, les souris déficientes pour le TLR9 et TLR2 simultanément présentent des charges parasitaires significativement plus élevées que celles déficientes pour le TLR9 seul (Bafica et al, 2006). Par la suite, il a été démontré que l’ADN de T. cruzi colocalise avec le TLR9 et le marqueur lysosomal LAMP-1 (Bartholomeu et al, 2008). L’étude de l’implication du TLR9 dans la réponse au T. cruzi a aussi révélé que son génome contient des motifs CpG activateurs qui, de manière surprenante, sont situés dans
des séquences particulières codant pour des rétrotransposons ou des gènes codant pour des glycoprotéines (Bartholomeu et al, 2008).
2. TLR9 et ADN de Plasmodium falciparum
De manière surprenante, il a été découvert que l’ADN de l’agent de la malaria, Plasmodium
falciparum, peut induire la signalisation du TLR9. En réalité, l’activation du TLR9 par l’ADN
du P. falciparum dépend de son interaction avec l’hémozoïne, qui le transporte aux endosomes (Parroche et al, 2007). L’hémozoïne est synthétisé par le parasite dans les érythrocytes, et résulte de l’activité parasitaire pour contrer la réponse oxydante de l’érythrocyte en transformant l’hème de l’hémoglobine en un crystal insoluble. Bien qu’il ait été démontré auparavant que l’hémozoïne seul pouvait activer le TLR9 (Coban et al, 2005), en réalité il active et interagit avec le TLR9 que lorsqu’elle est liée à l’ADN (Parroche et al, 2007). Comme la DOTAP, elle permettrait alors à l’ADN du parasite à avoir accès au TLR9 dans le compartiment endosomal pour induire son activation (Parroche et al, 2007). D’autres protéines telles que l’histone et d’autres protéines nucléaires, liées à l’ADN de P. falciparum et provenant du parasite, peuvent aussi permettre l’activation des cellules via le TLR9, alors que l’ADN seul ou l’histone seule n’induit pas d’activation (Gowda et al, 2011).
La faible activation TLR9 par le génome du parasite P. falciparum peut s’expliquer par son faible contenu en motifs CpG. Quasiment la totalité des motifs CpG retrouvés dans son génome ressemblent aux motifs CpG de la classe B, formés autour de la séquence RRCGYY, et les deux tiers de ces motifs sont localisés dans les régions sous-télomériques et dans des gènes codant pour des antigènes caractéristiques du parasite (tels PfEMP1) (Parroche et al, 2007). En étudiant sa richesse en bases AT (environ 80%) et le motif immuno-stimulateur ATTTTTAC (Shimosato et al, 2006), il apparaît que ce motif est très présent (plus de 6000 fois) dans le génome du parasite et qu’il cause la production de cytokines pro-inflammatoires et d’IFN de type 1 (Sharma et al, 2011). La réponse est médiée par des senseurs cytosoliques de l’ADN impliquant STING, TBK1 et IRF3-IRF7 et ne concerne le TLR9 que lorsque la translocation endosomale de l’ADN du parasite est forcée, en présence de DOTAP par exemple (Sharma et al, 2011).
3. TLR9 et ADN de Toxoplasma gondii
L’implication de différents TLR a été démontrée dans la réponse contre le parasite
Toxoplasma gondii dont les TLR2 et TLR4 contre ses molécules phospho-glyco-conjuguées
de surface (Debierre-Grockiego et al, 2007), les TLR 7 et TLR9 contre l’ARN et l’ADN du parasite (Andrade et al, 2013) et les TLR11 et TLR12 contre la profiline, une protéine se liant à l’actine et participant au fonctionnement du cytosquelette (Yarovinsky et al, 2005 ; Koblanski et al, 2013). Cependant, alors que les souris déficientes pour MyD88 sont très sensibles au parasite T. gondii, les souris déficientes pour les TLR2 et TLR4 présentent une sensibilité limitée. Il s’agit surtout des souris déficientes pour les TLR endosomaux (TLR7, TLR9 et TLR11) qui présentent une grande sensibilité au parasite, suggérant que les TLR endosomaux auraient un rôle plus important que les autres TLR (Andrade et al, 2013).
HYPOTHESES ET OBJECTIFS DE LA THESE
Dans un modèle de souris C57BL/6, l’équipe avait précédemment montré que le récepteur
TLR9 était impliqué dans la résistance à l’infection par Leishmania major. Les souris TLR9
-/-sont en effet plus sensibles à l’infection. Au niveau du site de l’infection, dans les ganglions drainants, des différences dans l’expression des cytokines entre les lignées C57BL/6 et
TLR9-/- indiquent que l’établissement d’une réponse Th1 est retardée dans la lignée TLR9
-/-(Abou Fakher et al, JI, 2009).
Le rôle précoce du TLR9 dans la réponse immunitaire contre L. major a été mis en évidence dans les cellules dendritiques (DCs) de souris. In vitro, le parasite L. major induit l’expression de molécules de co-stimulation (CD40 et CD80) et de cytokines pro-inflammatoires dans les
cellules dendritiques (DCs) de C57BL/6 mais pas dans celles de TLR9-/-. Le composant du
parasite capable d’activer la signalisation TLR9 est l’ADN génomique de L. major. Il s’agit d’une activation spécifique par l’ADN du parasite puisque les ADNs de vertébrés seuls sont incapables de stimuler les DCs.
Dans la première partie, nous avons entrepris de déterminer les propriétés de l’ADN de L.
major lui permettant d’induire l’activation du TLR9. Deux hypothèses ont été testées :
- L’implication de la voie d’internalisation de l’ADN dans les cellules. - L’importance de la séquence et de la structure de l’ADN du parasite.
On considère aujourd’hui que l’activation du TLR9 ne dépend pas uniquement de son ligand mais de cofacteurs capables d’interagir avec le TLR9 ou avec l’ADN. De plus, alors que le CpG non méthylé avait été décrit comme l’élément activateur du TLR9, il a été proposé par la suite que l’activation du TLR9 repose en réalité sur la charpente désoxyribose (constituée de liaisons phosphodiester), indépendamment des bases associées. Enfin, l’ADN endogène n’ayant pas accès au TLR9, cela protégerait la cellule d’une réaction contre le soi, et les voies d’accès au TLR9 pourraient donc jouer un rôle essentiel dans l’activation par l’ADN de parasite.
Par ailleurs, l’activation du TLR9 nécessite son clivage par des protéases et s’accompagne d’une maturation et d’une acidification du pH endosomales. En effet, alors que tous les deux
ont la capacité de lier le TLR9, un ADN activateur induit le changement de conformation du TLR9 contrairement à un ADN non activateur. Il avait donc été proposé que la stimulation par un ADN activateur induit le clivage du TLR9. Mais par la suite, l’existence d’un TLR9 clivé présent avant toute activation a aussi remis en cause a aussi remis en cause la nécessité de la stimulation par l’ADN activateur pour que le clivage ait lieu.
Dans la seconde partie, notre objectif était de discriminer le rôle des macrophages et des cellules dendritiques dans la réponse immunitaire à l’infection via la signalisation du TLR9, grâce à l’existence de souris déficientes pour différentes protéases intervenant dans la maturation du TLR9 (AEP et CatL, CatB, CatS).
L’asparagine endopeptidase (AEP) et les cathepsines (Cat) sont impliquées dans le clivage du TLR9. L’AEP joue un rôle important dans les DCs, elle clive le TLR9 à un pH 5.5. En revanche, dans les macrophages, le pH est plus acide et optimal pour la cathepsine L (CatL), alors que le rôle de l’AEP n’est pas essentiel. Plusieurs protéases peuvent intervenir dans la maturation du TLR9. A côté de la cathepsine L dans les macrophages, d’autres cathepsines dont les cathepsines B (CatB) et S (CatS) peuvent aussi être impliquées.